Hårnålsribozym
Hårnålsribozym är en liten del av RNA som kan fungera som ett ribozym . Liksom hammarhuvudsribozymet finns det i RNA- satelliter från växtvirus. Det identifierades först i minussträngen av tobaksringfläcksvirus (TRSV) satellit-RNA där det katalyserar självklyvning och sammanfogningsreaktioner ( ligeringsreaktioner ) för att bearbeta produkterna från replikering av rullande cirkelvirus till linjära och cirkulära satellit-RNA-molekyler. Hårnålsribozymet liknar hammarhuvudribozymet genom att det inte kräver en metalljon för reaktionen.
Biologisk funktion
Hårnålsribozymet är ett RNA-motiv som katalyserar RNA-bearbetningsreaktioner som är nödvändiga för replikering av satellit-RNA-molekylerna i vilka det är inbäddat. Dessa reaktioner är självbearbetande, dvs en molekyl som omarrangerar sin egen struktur. Både klyvnings- och ändsammanfogningsreaktioner medieras av ribozymmotivet, vilket leder till en blandning av interkonvertibla linjära och cirkulära satellit-RNA-molekyler. Dessa reaktioner är viktiga för att bearbeta de stora multimera RNA-molekylerna som genereras genom replikering av rullande cirkel . I slutet av replikationscykeln bearbetas dessa stora mellanprodukter av satellit-RNA-replikation ner till enhetslängdsmolekyler (cirkulära eller linjära) innan de kan packas av virus och transporteras till andra celler för ytterligare replikeringsronder.
Naturliga versioner av hårnålsribozym
På 1980-talet identifierades hårnålsribozymet i tre naturligt förekommande och välkarakteriserade sekvenser:
- satellit-RNA från tobaksringfläcksvirus (sTRSV)
- satellit-RNA av cikoriagul fläckvirus (sCYMV)
- satellit-RNA av arabis mosaikvirus (sARMV)
Senare arbete 2021 avslöjade nästan 1000 hårnålsribozymsekvenser i till stor del okända organismer som hittades i metatranskriptomdata. Dessa nyare sekvenser antogs förekomma i organismer som, liksom de som innehåller de tre tidigare hittade hårnålsribozymen, använder enkelsträngade, cirkulära RNA-genom. Genomernas cirkularitet stöddes experimentellt, men organismernas vidare natur har ännu inte studerats väl.
Konstgjorda versioner av hårnålsribozym
Mindre artificiella versioner av hårnålsribozym har utvecklats för att möjliggöra en mer detaljerad experimentell analys av molekylen. Detta är en vanlig strategi för att separera de delar av en självbearbetande RNA-molekyl som är väsentliga för RNA-bearbetningsreaktionerna från de delar som har orelaterade funktioner. identifierades en minimal katalytisk domän på 50 nukleotider och ett substrat på 14 nukleotider. Med användning av dessa artificiellt härledda sekvenser utvecklades ett transverkande ribozym som kan katalysera klyvningen av flera substratmolekyler. Denna strategi var viktig eftersom den gjorde det möjligt för utredare att (i) tillämpa biokemiska metoder för enzymatisk analys, (ii) genomföra experiment för att identifiera väsentliga strukturella element i ribozym-substratkomplexet och (iii) utveckla konstruerade ribozymer som har använts för biomedicinsk tillämpningar, inklusive förhindrande av replikering av patogena virus, och studiet av funktionen hos individuella gener.
Reaktionskemi
I likhet med flera andra ribozymer och proteinribonukleas genererar klyvningsreaktionen av hårnålsribozymet RNA-fragment med ändar bestående av ett 2',3'-cykliskt fosfat och en 5'-hydroxylgrupp. Ligeringsreaktionen verkar vara en enkel omkastning av klyvning, dvs kovalent sammanfogning av RNA-fragment som slutar med ett 2',3'-cykliskt fosfat och en 5'-hydroxylgrupp för att generera den vanliga 3'-5' fosfodiesterbindningen som används i båda RNA och DNA.
Studier av denna reaktion i flera ribozymer har tjänat till att fastställa att reaktionskemin (katalytisk mekanism) är en endogen egenskap hos själva RNA-molekylen och inte medieras av metalljoner, vilket är sant för vissa proteinenzymer och vissa andra ribozymer. Dessutom observeras fortfarande klyvningsaktivitet när Mg2 + ersätts med [Co( NH3 ) 6 ] 3+ . Co 3+ binder NH 3 så hårt i lösning att NH 3 inte dissocierar i någon nämnvärd utsträckning, och därför inte blir protonerad. Detta tyder på att det inte finns någon metallkatalyserad protonöverföring eller direkt koordination till RNA:t, utan istället krävs metaller bara för att vika. Vidare, i kristallstrukturer av ett ribozym-inhibitorkomplex och en övergångstillståndsmimik, visades det att den tredimensionella arkitekturen sprider isär A-1 och G+1, vilket positionerar 2'-OH av A-1 för en in- linje nukleofil attack på den sprickbara fosfatkopplingen. Dessutom har G8, A38 och A9 föreslagits spela roller i katalysen genom att deprotonera 2'-OH i A-1, stabilisera den negativa laddningen av pentakoordinatfosfatsyrer och protonera den lämnande 5'-O-gruppen av G+1.
Strukturera
Det minimala hårnålsribozym-substratkomplexet viks till en sekundär struktur som inkluderar två domäner, som var och en består av två korta basparade helixar åtskilda av en inre slinga. Domän A (helix 1 – loop A – helix 2) innehåller substratet och den primära substratigenkänningsregionen för ribozym. Domän B (helix 3 – loop B – helix 4) är större och innehåller de primära katalytiska determinanterna för ribozym. De två domänerna är kovalent förenade via en fosfodiesterbindning som förbinder helix 2 med helix 3. Dessa domäner måste interagera med varandra för att katalys ska ske.
När det minimala ribozym-substratkomplexet tillåts vikas under förhållanden med låg jonstyrka , staplas de två domänerna ovanpå varandra och bildar en inaktiv, förlängd struktur som liknar en hårnål. För att katalys ska kunna inträffa ligger de två domänerna parallellt med varandra i ett veck som liknar ett gem. I olika publikationer har detta RNA benämnts antingen "gem" eller "hårnåls" ribozym. Trots att det förra namnet har visat sig vara mer korrekt har det senare blivit den allmänt accepterade nomenklaturen. I laboratoriet främjas en funktionell interaktion mellan de två domänerna genom tillsats av katjoner , vars positiva laddning räcker för att övervinna den elektrostatiska repulsionen av den negativt laddade RNA-ryggraden. I naturen underlättas association av de två domänerna genom en kombination av metalljoner (inklusive Mg2+ ) och närvaron av ytterligare två spiralformade domäner som inte finns i det minimala ribozym-substratkomplexet men tjänar till att främja korrekt tredimensionell vikning . Dessa ytterligare domäner staplas på spiralerna 2 och 3, och främjar därigenom associationen av de två funktionella domänerna genom vad som kallas en fyrvägs spiralövergång.
Strukturen och aktiviteten av hårnålsribozymet har utforskats med ett brett utbud av komplementära experimentella metoder, inklusive nukleotidersättning, funktionell gruppsubstitution, kombinatoriskt urval, fluorescensspektroskopi, kovalent tvärbindning , NMR - analys och röntgenkristallografi . Dessa studier har underlättats av förmågan hos det funktionella komplexet att självbilda sig från segment gjorda av kemisk RNA-syntes i fast fas, vilket möjliggör inkorporering av en mängd olika modifierade nukleotider som inte finns naturligt i RNA. Tillsammans presenterar resultaten av dessa experiment en mycket kongruent bild av den katalytiska cykeln , dvs hur hårnålsribozymet binder sitt substrat, viker sig in i en specifik tredimensionell struktur, katalyserar reaktionen och frigör produkten/produkterna från reaktionen.
Riktad RNA-klyvning och antiviral aktivitet
Hårnålsribozymer har modifierats på ett sådant sätt att de kan användas för att rikta klyvning av andra RNA-molekyler. Detta är möjligt eftersom mycket av substratspecificiteten hos hårnålsribozymet härrör från enkel Watson-Crick- basparning inom spiral 1 och 2.
Ett område av särskilt intresse har varit utvecklingen av hårnålsribozymer för potentiell terapeutisk användning, till exempel genom att förhindra replikering av patogena virus. Antivirala hårnålsribozymer har genererats och uttryckts i däggdjursceller, och celler som uttrycker olika konstruerade ribozymer har visat sig vara resistenta mot infektion av HIV-1, hepatit B och Sindbis-virus .
Vidare läsning
- Doherty, EA; Doudna JA (2001). "Ribozymstrukturer och mekanismer". Annu Rev Biophys Biomol Struct . 30 : 457-475. doi : 10.1146/annurev.biophys.30.1.457 . PMID 11441810 .
- Ferré-D'Amaré, AR; Rupert PB (2002). "Hårnålsribozym: från kristallstruktur till funktion" . Biochem Soc Trans . 30 (Pt 6): 1105–1109. doi : 10.1042/BST0301105 . PMID 12440983 . S2CID 32576742 .