Survivin

BIRC5
Protein BIRC5 PDB 1e31.png
Tillgängliga strukturer
PDB Ortologisk sökning:
Identifierare
, API4, EPR-1, baculoviral IAP-upprepning som innehåller 5
externa ID:n
Ortologer
Arter Mänsklig Mus
Entrez
Ensembl
UniProt
RefSeq (mRNA)

RefSeq (protein)

Plats (UCSC)
PubMed -sökning
Wikidata
Visa/redigera människa Visa/redigera mus

Survivin , även kallad bakuloviral inhibitor of apoptosis repeat-innehållande 5 eller BIRC5 , är ett protein som hos människor kodas av BIRC5 -genen .

Survivin är en medlem av familjen apoptoshämmare (IAP). Survivinproteinet fungerar för att hämma kaspasaktivering , vilket leder till negativ reglering av apoptos eller programmerad celldöd . Detta har visats genom störningar av survivininduktionsvägar som leder till ökning av apoptos och minskning av tumörtillväxt. Survivinproteinet uttrycks starkt i de flesta mänskliga tumörer och fostervävnad, men är helt frånvarande i terminalt differentierade celler. Dessa data tyder på att survivin kan ge ett nytt mål för cancerterapi som skulle skilja mellan transformerade och normala celler. Survivin-uttryck är också starkt reglerat av cellcykeln och uttrycks endast i G2-M-fasen. Det är känt att Survivin lokaliseras till den mitotiska spindeln genom interaktion med tubulin under mitos och kan spela en bidragande roll för att reglera mitos. De molekylära mekanismerna för survivinreglering är fortfarande inte väl förstått, men reglering av survivin verkar vara kopplad till p53 -proteinet. Det är också en direkt målgen för Wnt-vägen och uppregleras av beta-catenin .

IAP-familj av anti-apoptotiska proteiner

Survivin är en medlem av IAP-familjen av antiapoptotiska proteiner . Det har visat sig vara bevarat i funktion över hela evolutionen eftersom homologer av proteinet finns både hos ryggradsdjur och ryggradslösa djur . De första medlemmarna av de identifierade IAP:erna var från baculovirus- IAP:erna, Cp-IAP och Op-IAP, som binder till och hämmar kaspaser som en mekanism som bidrar till dess effektiva infektions- och replikationscykel i värden. Senare upptäcktes ytterligare fem mänskliga IAP som inkluderade XIAP , c-IAPl , C-IAP2 , NAIP och survivin. Survivin, liksom de andra, upptäcktes genom sin strukturella homologi med IAP-familjen av proteiner i humant B-cellslymfom . De humana IAP:erna, XIAP, c-IAPl, C-IAP2 har visats binda till kaspas-3 och -7 , som är effektorkaspaserna i signalvägen för apoptos. Det är dock inte känt med absolut säkerhet hur IAPs hämmar apoptos mekanistiskt på molekylär nivå.

En gemensam egenskap som finns i alla IAP i närvaro av en BIR (Baculovirus IAP Repeat, ett ~70 aminosyror motiv) i en till tre kopior. Det visades av Tamm et al. att det var tillräckligt att slå ut BIR2 från XIAP för att orsaka en funktionsförlust när det gäller XIAPs förmåga att hämma kaspaser. Detta ger implikationen att det är inom dessa BIR-motiv som innehåller den anti-apoptotiska funktionen hos dessa IAP. Survivins ena BIR-domän visar en liknande sekvens jämfört med den för XIAP:s BIR-domäner.

Isoformer

Den enda survivingenen kan ge upphov till fyra olika alternativt splitsade transkript:

  1. Survivin , som har en struktur med tre intron-fyra exoner hos både mus och människa.
  2. Survivin-2B , som har en insättning av en alternativ exon 2.
  3. Survivin-Delta-Ex-3 , som har exon 3 avlägsnat. Avlägsnandet av exon 3 resulterar i ett ramskifte som genererar en unik karboxylterminal med en ny funktion. Denna nya funktion kan involvera en nukleär lokaliseringssignal. Dessutom genereras också en mitokondriell lokaliseringssignal.
  4. Survivin-3B , som har en insättning av en alternativ exon 3.

Strukturera

Ett strukturellt särdrag som är gemensamt för alla proteiner i IAP-familjen är att de alla innehåller minst en baculoviral IAP repeat ( BIR ) domän som kännetecknas av ett konserverat zinkkoordinerande Cys/His-motiv vid den N-terminala halvan av proteinet.

Survivin särskiljs från andra IAP-familjemedlemmar genom att det bara har en BIR-domän. Mössen och human BIR-domän av survivin är mycket lika strukturellt förutom två skillnader som kan påverka funktionsvariabiliteten. Den mänskliga survivinen innehåller också en långsträckt C-terminal helix omfattande 42 aminosyror. Survivin är 16,5 kDa stor och är den minsta medlemmen i IAP-familjen. Röntgenkristallografi har visat att två överlevande mänskliga molekyler går samman för att bilda en röjslipsformad dimer genom ett hydrofobt gränssnitt. Detta gränssnitt inkluderar N-terminala rester 6-10 strax före BIR-domänregionen och 10-restregionen som ansluter BIR-domänen till C-terminal helix. Den strukturella integriteten för den bestämda kristallstrukturen av survivin är ganska tillförlitlig, eftersom fysiologiska förhållanden användes för att erhålla bilderna.

Fungera

Apoptos

Apoptos , processen för programmerad celldöd, involverar komplexa signalvägar och kaskader av molekylära händelser. Denna process behövs för korrekt utveckling under embryonal och fostertillväxt där det sker förstörelse och rekonstruktion av cellulära strukturer. Hos vuxna organismer behövs apoptos för att upprätthålla differentierad vävnad genom att hitta balansen mellan proliferation och celldöd. Det är känt att intracellulära proteaser som kallas kaspaser bryter ned det cellulära innehållet i cellen genom proteolys vid aktivering av dödsvägen.

Däggdjursceller har två huvudvägar som leder till apoptos.

1. Extrinsic pathway : Initierad av extrinsiska ligander som binder till dödsreceptorer på cellens yta. Ett exempel på detta är bindningen av tumörnekrosfaktor-alfa ( TNF-alfa ) till TNF-alfa-receptorn . Ett exempel på en TNF-receptor är Fas ( CD95 ), som rekryterar aktivatorkaspaser som kaspas-8 vid bindning av TNF vid cellytan. Aktiveringen av initiatorkaspaserna initierar sedan en nedströmskaskad av händelser som resulterar i induktionen av effektorkaspaser som fungerar i apoptos.

2. Inre väg : Denna väg initieras av intracellulära eller miljömässiga stimuli. Den är fokuserad på att upptäcka den felaktiga funktionen av mitokondrierna i cellen och, som ett resultat, aktiverar signalvägar för att begå självmord. Mitokondriernas membranpermeabilitet ökar och särskilda proteiner frisätts i cytoplasman som underlättar aktiveringen av initiatorkaspaser. Det speciella proteinet som frisätts från mitokondrierna är cytokrom c . Cytokrom c binder sedan till Apaf-1 i cytosolen och resulterar i aktivering av initiatorkaspas-9. Aktiveringen av initiatorkaspaserna initierar sedan en nedströmskaskad av händelser som resulterar i induktionen av effektorkaspaser som fungerar i apoptos.

En familj av proteiner som kallas IAP spelar en roll för att reglera celldöd genom att hämma processen. IAPs som survivin, hämmar apoptos genom att fysiskt binda till och hämma korrekt kaspasfunktion. Funktionen av IAPs är evolutionärt bevarad eftersom Drosophila-homologer av IAP:er har visat sig vara väsentliga för cellöverlevnad.

IAPs har varit inblandade i studier för att ha en reglerande effekt på celldelning. Jästceller med knock-outs av vissa IAP-gener visade inte problem associerade med celldöd, men visade defekter i mitos som kännetecknas av felaktig kromosomsegregering eller misslyckad cytokines.

Borttagning av särskilda IAP:er verkar inte ha någon djupgående effekt på celldödsvägen eftersom det finns en överflödig funktion av de många IAP:er som finns i en cell. De har emellertid varit inblandade i att spela en roll för att upprätthålla en anti-apoptotisk miljö intracellulärt. Ändring av uttrycket av särskilda IAP har visat en ökning av spontan celldödsinduktion eller ökad känslighet för dödsstimuli.

Handlingsmekanism

Hämning av Bax och Fas-inducerad apoptos

Tamm et al. har visat att survivin hämmar både Bax- och Fas -inducerade apoptotiska vägar. Experimentet involverade transfektering av HEK 293-celler med en Bax-kodande plasmid, vilket resulterade i en ökning av apoptos (~7 gånger) mätt med DAPI- färgning. De kontransfekterade sedan 293-cellerna med Bax-kodande plasmider och survivin-kodande plasmider. De observerade att celler transfekterade tillsammans med survivin visade en signifikant minskning av apoptos (~ 3 gånger). Ett liknande resultat visade också för celler transfekterade med den Fas-överuttryckande plasmiden. Immunoblots utfördes och bekräftade att survivin inte hämmar genom mekanismer för att förhindra Bax- eller Fas-protein från att göras till fullt fungerande proteiner. Därför bör survivin agera någonstans nedströms Bax- eller Fas-signalvägen för att hämma apoptos genom dessa vägar.

Interaktion med kaspas-3 och -7

I denna del av experimentet, Tamm et al. transfekterade 293-celler med survivin och lyserade dem för att erhålla cellysat. Lysaten inkuberades med olika kaspasformer och survivin immunopererades med anti-survivinantikropp. Tanken bakom detta är att om survivin binder fysiskt till kaspaset det inkuberas med, kommer det att samutfällas tillsammans med survivin medan allt annat i lysatet sköljs bort. Immunfällningarna kördes sedan på SDS-PAGE och immunoblottedes sedan för detektion av det önskade kaspaset. Om kaspaset av intresse detekterades, betydde det att det var bundet till survivin i immunoutfällningssteget, vilket implicerade att survivin och det specifika kaspaset hade bundits i förväg. Aktivt kaspas-3 och -7 samimmunoutfällts med survivin. De inaktiva proformerna av kaspas-3 och -7 band inte survivin. Survivin binder inte heller till aktivt kaspas-8. Kaspas-3 och -7 är effektorproteaser medan kaspas-8 är ett initiator-kaspas som sitter mer uppströms i den apoptotiska vägen. Dessa resultat visar survivins förmåga att binda med speciella kaspaser in vitro , men behöver inte nödvändigtvis översättas till faktiska fysiologiska tillstånd. Senare bekräftade en studie från 2001 att humant survivin binder kaspas-3 och -7 när det uttrycks i E. coli .

Ytterligare bevis för att stödja idén att survivin blockerar apoptos genom att direkt hämma kaspaser gavs av Tamm et al. 293-celler transfekterades med antingen överexponerad kaspas-3- eller -7-kodande plasmid och med survivin. De visade att survivin hämmade bearbetningen av dessa två kaspaser till deras aktiva former. Även om survivin som nämnts ovan har visat sig binda endast till de aktiva formerna av dessa kaspaser, är det här troligt att survivin hämmar de aktiva formerna av kaspaserna som är resultatet av klyvning och aktivering av fler av dess egna proformer. Således verkar survivin möjligen genom att förhindra en sådan kaskad av klyvning och aktiveringsförstärkning från att inträffa, vilket resulterar i minskad apoptos.

, uttrycktes cytokrom c övergående i 293 celler för att titta på de hämmande effekterna som survivin hade på denna väg. Även om detaljerna inte finns här, visades survivin också hämma cytokrom c och kaspas-8-inducerad aktivering av kaspaser.

Reglering av cytokines

Medan mekanismen genom vilken survivin kan reglera cellmitos och cytokines inte är känd, tyder observationerna på dess lokalisering under mitos starkt att det är involverat på något sätt i den cytokinetiska processen.

Prolifererande Daoy-celler placerades på ett täckglas, fixerades och färgades med fluorescerande antikroppar för survivin och alfa-tubulin. Immunfluorescens med konfokalmikroskopi användes för att titta på lokaliseringen av survivin och tubulin under cellcykeln för att leta efter eventuella mönster av survivinuttryck. Survivin var frånvarande i interfas , men närvarande i G2 - M -fasen.

Under mitosens olika stadier kunde man se att survivin följer ett visst lokaliseringsmönster. Vid profas och metafas är survivin huvudsakligen nukleärt på sin plats. Under profasen, när kromatinet kondenserar så att det är synligt under mikroskopet, börjar survivin att flytta till centromererna. Vid prometafas när kärnmembranet dissocierar och spindelmikrotubuli korsar den nukleära regionen, stannar survivin kvar vid centromererna . Vid metafas, när kromosomerna är i linje med mittplattan och dras med hög spänning till endera polen av kinetokorfästena, associerar survivin sedan med kinetokorerna. Vid anafas när separering av kromatiderna sker, förkortas kinetochore-mikrotubuli när kromosomerna rör sig mot spindelpolerna och survivin rör sig också till mittplattan. Survivin ackumuleras således vid mittplattan vid telofas. Slutligen lokaliseras survivin till mellankroppen vid klyvningsfåran.

Interaktion och lokalisering till mitokondrierna

Det har visats att survivin kan heterodimerisera individuellt med de två splitsningsvarianterna Survivin-2B och survivin-deltaEx3. Bevis på heterodimerisering av survivin-splitsvarianter med survivin visades med samimmunoprecipitationsexperiment efter samtransfektion med respektive survivinvarianter med survivin. För att bestämma lokaliseringen av exogent uttryckt survivin-2B och survivin-deltaEx3, gjordes fusionskonstruktioner av proteinerna med GFP respektive HcRed och Daoy-celler transfekterades med plasmidkonstruktionerna. Survivin var också märkt med ett fluorescerande protein. Fusionen av survivin-varianterna med de fluorescerande molekylerna möjliggör enkel detektering av cellulär lokalisering genom fluorescensmikroskopi. Survivin-2B i sig, lokaliserat till både nukleära och cytoplasmatiska avdelningar medan survivin-deltaEx3 endast lokaliserades i kärnan. Lokaliseringen av de tre varianterna (survivin, Survivin-2B och survivin-deltaEx3) skiljer sig dock åt när de samtransfekteras tillsammans snarare än individuellt.

För att se vilka subcellulära avdelningar som innehöll survivin-splitsningsvariantkomplexen användes fluorescerande antikroppsmarkörer för olika organeller i cellen. Antagandet är att under fluorescensmikroskopi, om det specifika survivinkomplexet är lokaliserat i det specifika cellutrymmet, skulle man observera en överlappning från fluorescensen som avges av det taggade survivinkomplexet och det taggade facket också. Olika färgfluorescens används för att skilja avdelning från survivin.

  • Endoplasmatiskt retikulum och lyosomer : ingen kolokalisering
  • Mitokondrier och golgi : både survivin/survivin-2B och survivin/survivin-deltaEx3 kolokaliserar

För att verifiera dessa observationer fraktionerade de de subcellulära avdelningarna och utförde western blot-analys för att definitivt säga att survivinkomplex verkligen lokaliserades vid dessa avdelningar.

Roll i cancer

Uttryck i olika karcinom

Survivin är känt för att uttryckas under fosterutveckling och över de flesta tumörcelltyper, men är sällan närvarande i normala, icke-maligna vuxna celler. Tamm et al. visade att survivin uttrycktes i alla 60 olika humana tumörlinjer som användes i National Cancer Institutes screeningprogram för cancerläkemedel, med de högsta nivåerna av uttryck i bröst- och lungcancerlinjer och de lägsta nivåerna i njurcancer . Att känna till de relativa expressionsnivåerna av survivin i olika tumörtyper kan visa sig vara till hjälp eftersom survivinrelaterad terapi kan administreras beroende på tumörtypens uttrycksnivå och beroende av survivin för resistens mot apoptos.

Som en onkogen

Survivin kan betraktas som en onkogen eftersom dess avvikande överuttryck i de flesta cancerceller bidrar till deras motståndskraft mot apoptotiska stimuli och kemoterapeutiska terapier, vilket bidrar till deras fortsatta överlevnad.

Genomisk instabilitet

De flesta cancerformer hos människor har visat sig ha vinster och förluster av kromosomer som kan bero på kromosomal instabilitet ( CIN). En av de saker som orsakar CIN är inaktiveringen av gener som kontrollerar den korrekta segregeringen av systerkromatiderna under mitos. För att få en bättre förståelse av survivins funktion i mitotisk reglering har forskare undersökt området genomisk instabilitet. Det är känt att survivin associerar med mikrotubuli i den mitotiska spindeln i början av mitos.

Det har visat sig i litteraturen att utslag av survivin i cancerceller kommer att störa mikrotubulibildning och resultera i polyploidi såväl som massiv apoptos. Det har också visats att celler som är utarmade av survivin lämnar mitos utan att uppnå korrekt kromosomanpassning och sedan reformerar enstaka tetraploida kärnor. Ytterligare bevis tyder också på att survivin behövs för att upprätthålla mitosstopp vid möte med mitosproblem. Bevisen som nämns ovan implicerar att survivin spelar en viktig reglerande roll både i utvecklingen av mitos och upprätthållande av mitotiskt arrest. Detta verkar konstigt, eftersom survivin är känt för att vara mycket uppreglerat i de flesta cancerceller (som vanligtvis innehåller kromosominstabilitetsegenskaper), och dess funktion är den som främjar korrekt reglering av mitos.

Reglering av p53

p53 hämmar survivin-uttryck på transkriptionsnivå

Vildtyp p53 har visat sig undertrycka survivin-uttryck på mRNA-nivå. Med användning av en adenovirusvektor för vildtyp p53, transfekterades human äggstockscancercellinje 2774qw1 (som uttrycker mutant p53). mRNA-nivåer av survivin analyserades med kvantitativ PCR i realtid ( RT-PCR ) och visade tidsberoende nedreglering av survivin-mRNA-nivåer när cellerna infekterades med vildtyp p53. En 3,6-faldig minskning av survivin-mRNA-nivån observerades 16 timmar efter infektionsinitiering och minskade 6,7 gånger 24 timmar efter infektion. Western blot-resultat visar att det verkligen finns att p53 från den adenovirala vektorn uttrycktes i cellerna med användning av antikroppar specifik för p53. Uttrycket av p53-nivåer som indikerar dess roll i survivin-repression visar att p53 började uttryckas 6 timmar efter infektion och hade sin högsta nivå vid 16–24 timmar. För att ytterligare bekräfta att endogen vildtyp p53 verkligen orsakar undertryckandet av survivin-genexpression, inducerade författarna A549 (human lungcancercellinje med vildtyp p53) och T47D (human bröstcancercellinje med mutant p53) celler med DNA -skadligt medel adriamycin för att utlösa det fysiologiska p53-apoptotiska svaret i dessa cancerceller och jämföra survivinnivåerna uppmätta med samma celler utan induktion av DNA-skada. A549-linjen, som i sig har fungerande vildtyp p53, visade signifikant minskning av survivinnivåer jämfört med icke-inducerade celler. Samma effekt sågs inte i T47D-celler som bär mutant inaktiv p53.

P53:s normala funktion är att reglera gener som kontrollerar apoptos. Eftersom survivin är en känd hämmare av apoptos, kan det antydas att p53-repression av survivin är en mekanism genom vilken celler kan genomgå apoptos vid induktion av apoptotiska stimuli eller signaler. När survivin överuttrycks i cellinjerna som nämns i föregående stycke, minskade apoptotisk respons från det DNA-skadande medlet adriamycin på ett dosberoende sätt. Detta tyder på att nedreglering av survivin av p53 är viktig för att p53-medierad apoptotisk väg framgångsrikt ska resultera i apoptos. Det är känt att en avgörande egenskap hos de flesta tumörer är överuttrycket av survivin och den fullständiga förlusten av vildtyp p53. Bevisen som lagts fram av Mirza et al. visar att det finns ett samband mellan survivin och p53 som möjligen kan förklara en kritisk händelse som bidrar till cancerprogression.

p53 undertryckande av survivin-uttryck

För att se om p53-återuttryck i cancerceller (som har förlorat p53-uttryck) har den undertryckande effekten på promotorn av survivingenen, gjordes en luciferasreporterkonstruktion. Den isolerade survivinpromotorn placerades uppströms om luciferasreportergenen. I en luciferasreporteranalys, om promotorn är aktiv, transkriberas luciferasgenen och translateras till en produkt som avger ljus som kan mätas kvantitativt och således representerar promotorns aktivitet. Denna konstruktion transfekterades in i cancerceller som hade antingen vildtyp eller mutant p53. Hög luciferasaktivitet mättes i cellerna med mutant p53 och signifikant lägre luciferasnivåer mättes för celler med vildtyp p53.

Transfektion av olika celltyper med p53 av vildtyp associerades med ett starkt undertryckande av survivinpromotorn. Transfektion med mutant p53 visade sig inte kraftigt undertrycka survivinpromotorn. Fler luciferaskonstruktioner framställdes med varierande grader av deletion från 5'-änden av survivinpromotorregionen. Vid ett tillfälle var det deletion som gjorde att survivinnivåerna var likgiltiga för närvaron av p53-överuttrycksplasmiden, vilket indikerar att det finns en specifik region proximalt till transkriptionsstartstället som behövs för p53- suppression av survivin. Även om det har visat sig att två p53-bindningsställen är belägna på survivingenpromotorn, har analys med användning av deletioner och mutationer visat att dessa ställen inte är väsentliga för transkriptionell inaktivering.

Istället observeras det att modifiering av kromatinet inuti promotorregionen kan vara ansvarig för transkriptionell repression av survivingenen. Detta förklaras nedan i avsnittet om epigenetisk reglering.

Cellcykelreglering

Survivin har visat sig vara tydligt reglerat av cellcykeln, eftersom dess uttryck visar sig vara dominant endast i G2/M-fasen. Denna reglering existerar på transkriptionsnivå, eftersom det finns bevis på närvaron av cellcykelberoende element/cellcykelgenhomologiregion (CDE/CHR)-boxar belägna i survivinpromotorregionen. Ytterligare bevis för att stödja denna regleringsmekanism inkluderar bevisen att surivin polyubiquineras och bryts ned av proteasomer under cellcykelns interfas. Dessutom har survivin visats lokaliseras till komponenter i den mitotiska spindeln under metafas och anafas av mitos. också visats in vitro . Det visas också att post-transkriptionell modifiering av survivin som involverar fosforylering av Thr34 leder till ökad proteinstabilitet i G2/M-fasen av cellcykeln.

Det är känt från Mirza et al. att repression av survivin av p53 inte är ett resultat av någon cellcykelprogressiv reglering. Samma experiment av Mirza et al. med avseende på bestämning av p53 upprepades suppression av survivin på transkriptionsnivå, men denna gång för celler som stoppats i olika stadier av cellcykeln. Det visades att även om p53 stoppar antalet celler i olika omfattning i olika faser, var den uppmätta nivån av survivin-mRNA och proteinnivåer desamma över alla prover transfekterade med vildtyp p53. Detta visar att p53 verkar på ett cellcykeloberoende sätt för att hämma survivinexpression.

Epigenetisk och genetisk reglering

Som observerats i litteraturen har survivin visat sig vara överuttryckt i många tumörtyper. Forskare är inte säkra på mekanismen som orsakar detta onormala överuttryck av survivin; dock är p53 nedreglerad i nästan alla cancerformer, så det är frestande att antyda att survivin-överuttryck beror på p53-inaktivitet. Wagner et al. undersökte den möjliga molekylära mekanismen involverad med överuttryck av survivin vid akut myeloid leukemi (AML). I sina experiment gjorde de både en epigenetisk och en genetisk analys av survivingenens promotorregion hos AML-patienter och jämförde observationerna med vad som sågs i perifera mononukleära blodceller (PBMC) som inte har visat sig uttrycka något survivin. Förutsatt att den molekylära mekanismen för återuttryck av survivin i cancerceller är på transkriptionsnivå, beslutade författarna att titta på särskilda delar av promotorregionen av survivin för att se vad som händer i cancerceller som inte händer i normala celler som gör att en så hög nivå av överlevnad uttrycks. När det gäller en epigenetisk mekanism för överlevnadsgenreglering, mätte författarna metyleringsstatusen för survivinpromotorn, eftersom det är accepterat att metylering av gener spelar en viktig roll i karcinogenes genom att tysta vissa gener eller vice versa. Författarna använde metyleringsspecifik polymeraskedjereaktion med bisulfitsekvenseringsmetoder för att mäta promotormetyleringsstatusen i AML och PBMC och fann ometylerade survivinpromotorer i båda grupperna. Detta resultat visar att DNA-metyleringsstatus inte är en viktig regulator för återuttryck av survivin under leukemogenes. Emellertid har De Carvalho et al. utförde en DNA-metyleringsscreening och identifierade att DNA-metylering av IRAK3 spelar en nyckelroll i uppreglering av survivin i olika typer av cancer, vilket tyder på att epigenetiska mekanismer spelar en indirekt roll vid onormalt överuttryck av survivin. När det gäller genetisk analys av survivin-promotorregionen behandlades det isolerade DNA från AML och PBMC med bisulfit, och survivin-promotorregionens sekvens amplifierades ut med PCR och sekvenserades för att leta efter några speciella genetiska förändringar i DNA-sekvensen mellan de två grupper. Tre enkelnukleotidpolymorfismer (SNP) identifierades och var alla närvarande både hos AML-patienter och hos friska donatorer. Detta resultat tyder på att förekomsten av dessa SNP:er i promotorregionen av survivingenen inte heller verkar ha någon betydelse för survivinexpression. Det har dock inte uteslutits ännu att det kan finnas andra möjliga epigenetiska mekanismer som kan vara ansvariga för en hög nivå av survivin-uttryck som observerats i cancerceller och inte i normala celler. Till exempel kan acetyleringsprofilen för survivin-promotorregionen också tittas på. Olika cancer- och vävnadstyper kan ha små eller signifikanta skillnader i hur survivinuttryck regleras i cellen, och således kan metyleringsstatusen eller genetiska skillnader i survivinpromotorn observeras vara olika i olika vävnader. Därför måste ytterligare experiment som bedömer den epigenetiska och genetiska profilen för olika tumörtyper undersökas.

Som ett drogmål

Uttryck i cancer som ett verktyg för cancerriktad terapi

Survivin är känt för att vara högt uttryckt i de flesta tumörcelltyper och frånvarande i normala celler, vilket gör det till ett bra mål för cancerterapi. Utnyttjandet av survivins överaktiva promotor i de flesta cancercelltyper möjliggör leverans av terapeutiska medel endast i cancerceller och avlägsnade från normala celler.

Små interfererande RNA (siRNA) är syntetiska antisensoligonukleotider till mRNA från genen av intresse som verkar för att tysta uttrycket av en viss gen genom dess komplementära bindning. siRNA, såsom LY2181308 , bundna till respektive mRNA resulterar i avbrott i translation av den specifika genen och därmed frånvaron av det proteinet i cellen. Användningen av siRNA har alltså stor potential att vara ett humant terapeutiskt medel, eftersom det kan rikta och tysta uttrycket av potentiellt vilket protein du vill. Ett problem uppstår när siRNA-uttryck i en cell inte kan kontrolleras, vilket gör att dess konstitutiva uttryck kan orsaka toxiska biverkningar. När det gäller praktisk behandling av cancer krävs det att antingen leverera siRNA specifikt till cancerceller eller kontrollera siRNA-uttrycket. Tidigare metoder för siRNA-terapi använder användningen av siRNA-sekvenser klonade in i vektorer under kontroll av konstitutivt aktiva promotorer. Detta orsakar ett problem, eftersom denna modell är ospecifik för cancerceller och skadar också normala celler. Genom att veta att survivin överuttrycks specifikt i cancerceller och saknas i normala celler, kan man antyda att survivinpromotorn endast är aktiv i cancerceller. Således kommer utnyttjandet av denna skillnad mellan cancerceller och normala celler att tillåta lämplig terapi riktad endast mot de celler i en patient som är skadliga. I ett experiment för att demonstrera denna idé, Trang et al. har skapat en cancerspecifik vektor som uttrycker siRNA för grönt fluorescerande protein (GFP) under den humana survivin-promotorn. MCF7 bröstcancerceller samtransfekterades med denna vektor och en GFP-uttryckande vektor också. Deras huvudsakliga upptäckt var att MCF7-celler transfekterade med siRNA-vektorn för GFP under survivin-promotorn hade en signifikant minskning av GFP-uttrycket sedan cellerna transfekterade med siRNA-vektorn under en icke-specifik cancerpromotor. Dessutom visade normala icke-cancerceller transfekterade på samma sätt som nämnts ovan ingen signifikant minskning av GFP-uttryck. Detta antyder att survivinpromotorn inte är aktiv i normala celler, och således kommer siRNA inte att uttryckas under en inaktiv survivinpromotor.

Antisens-oligonukleotider riktade mot survivin-mRNA

Eftersom det är känt att survivin överuttrycks i de flesta cancerformer, vilket kan bidra till cancercellernas motståndskraft mot apoptotiska stimuli från omgivningen. Användningen av antisense survivinterapi hoppas kunna göra cancerceller mottagliga för apoptos genom att eliminera survivinexpression i cancercellerna.

Olie et al. utvecklat olika 20-mer fosforotioat antisense oligonukleotider som riktar sig mot olika regioner i mRNA för survivingenen. Antisensfunktionen hos oligonukleotiderna tillåter bindning till överlevande mRNA och kan, beroende på vilken region det binder, hämma överlevande mRNA från att översättas till ett funktionellt protein. Realtids-PCR användes för att bedöma nivåerna av mRNA närvarande i en lungadenokarcinomcellinje A549 som överuttrycker survivin. Den bästa antisens-oligonukleotiden identifierades som effektivt nedreglerade survivin-mRNA-nivåer och resulterade i apoptos av cellerna. Survivins roll i cancerutveckling i samband med en signalväg är dess förmåga att hämma aktivering av nedströms kaspas-3 och -7 från apoptosinducerande stimuli. Överuttrycket av survivin i tumörer kan tjäna till att öka tumörernas motståndskraft mot apoptos och därmed bidra till cellodödlighet även i närvaro av dödsstimuli. I detta experiment visade sig oligonukleotiden 4003 som riktar sig mot nukleotiderna 232-251 av survivin-mRNA vara den mest effektiva för att nedreglera nivåerna av survivin-mRNA i A549-tumörlinjen. De 4003 oligonukleotiderna infördes i tumörcellerna genom transfektion. Ytterligare experiment utfördes sedan på 4003. Ett av de ytterligare experimenten involverade bestämning av den dosberoende effekten av 4003 på nedregleringen av survivin-mRNA-nivåer. Det visade sig att en koncentration av 400 nM resulterade i en maximal nedreglering av 70 % av det initiala survivin-mRNA som fanns närvarande. Ett annat experiment på 4003 involverade bedömning av eventuell biologisk eller cytotoxisk effekt 4003 nedreglering av survivin-mRNA har på A549-celler med hjälp av MTT-analysen. Antalet A549-celler transfekterade med 4003 minskade signifikant med ökande koncentration av 4003 jämfört med celler transfekterade antingen med en felparningsform av 4003- eller lipofektinkontrollen. Många fysiska observationer som bekräftade induktionen av apoptos år 4003 gjordes. Till exempel visade lysat av de 4003-behandlade cellerna ökade nivåer av kaspas-3-liknande proteasaktivitet; kärnor observerades vara kondenserade och kromatin fragmenterades.

Immunterapi mot cancer

Survivin har varit ett mål för uppmärksamhet under de senaste åren för cancerimmunterapi, eftersom det är ett antigen som framför allt uttrycks i cancerceller och saknas i normala celler. Detta beror på att survivin anses vara en avgörande aktör för tumöröverlevnad. Det har samlats mycket bevis under åren som visar att survivin är ett starkt T-cellsaktiverande antigen, och kliniska prövningar har redan inletts för att bevisa dess användbarhet i kliniken.

Aktivering av det adaptiva immunförsvaret

A. Cellulär T-cellsrespons

Det första beviset på igenkänning och dödande av survivinspecifik CTL visades i en analys där cytotoxiska T-celler (CTL) inducerade lys av B-celler transfekterade för att presentera survivinpeptider på dess yta. De naiva CD8+ T-cellerna grundades med dendritiska celler och kunde därför känna igen de specifika peptiderna av survivin som presenterades på ytan Major Histocompatibility Complex I (MHC I) molekyler av B-cellerna.

B. Humoralt antikroppssvar

Genom att ta blodprover från cancerpatienter har forskare hittat antikroppar som är specifika för survivin. Dessa antikroppar saknades i blodproverna från friska normala patienter. Därför visar detta att survivin kan framkalla ett fullständigt humoralt immunsvar. Detta kan visa sig användbart, eftersom man skulle kunna mäta nivån av survivinspecifika antikroppar i patientens blod som en monitor för tumörprogression. Vid förvärv av det humorala svaret på tumörantigener såsom survivin, aktiveras CD4+ T-celler för att inducera B-celler att producera antikroppar riktade mot de speciella antigenerna.

Isoleringen av de antikroppar som är specifika för survivinpeptider är användbar, eftersom man kan titta på strukturen och sekvensen av det epitopbindande spåret i antikroppen och därför härleda möjliga epitoper som kan passa i det speciella antikroppsspåret. Därför kan man bestämma den speciella peptiddelen av survivinproteinet som binds mest effektivt och vanligast av humorala antikroppar som genereras mot survivin. Detta kommer att leda till produktion av mer specifika survivinvacciner som innehåller en specifik del av survivinproteinet som är känt för att framkalla ett bra immunsvar, generera immunminne och möjliggöra skydd mot tumörutveckling.

Överuttryck i tumörer och metastaserande vävnader

Xiang et al. hittat ett nytt tillvägagångssätt för att hämma tumörtillväxt och metastasering genom att samtidigt attackera både tumören och dess kärl genom ett cytotoxiskt T-cellssvar (CTL) mot survivinproteinet, vilket senare kommer att resultera i aktivering av apoptos i tumörceller.

Idén och den allmänna principen bakom hans teknik beskrivs nedan. Möss immuniserades med oral vaccination och utsattes sedan för tumörutmaning genom att injicera dem i bröstet med ett visst antal tumörceller och en Matrigel förformad extracellulär matris för att hålla ihop tumörcellerna. Mössen avlivades och endotelvävnaden färgades med ett fluorescerande färgämne som skulle hjälpa till vid kvantifieringen av tumörneovaskularisering med hjälp av en Matrigel-analys. Det visade sig vara en signifikant skillnad mellan kontroll- och testgrupperna, varvid möss som gavs vaccinet hade mindre angiogenes från tumörutmaningen än kontrollmössen som inte gavs något av vaccinet före tumörutmaningen. In vitro-analyser och andra tester utfördes också för att validera idén om förekomsten av ett verkligt immunsvar för att stödja vad de observerade hos mössen. Till exempel isolerades mjälten på de utmanade mössen och mättes med avseende på närvaron av eventuella cytokiner, och specifikt aktiverade immuncellgrupper som skulle indikera att ett specifikt immunsvar inträffade vid vaccination. De isolerade CTL:erna som är specifika för survivinproteinet efter vaccination av mössen användes i cytotoxicitetsanalyser där möss-tumörceller som uttrycker survivin visade sig dödas vid inkubation med de specifika CTL:erna.

Genom att använda ett oralt DNA-vaccin som bärs i en försvagad icke-virulent form av Salmonella typhimurium, som samkodade sekretoriskt kemokin CCL21 och survivinprotein i C57BL/6J-möss, Xiang et al . har kunnat framkalla ett immunsvar utfört av dendritiska celler (DC) och CTL för att eliminera och undertrycka lungmetastaser av icke-småcelligt lungkarcinom. Aktiveringen av immunsvaret sker med största sannolikhet i det sekundära lymfoida organet som kallas Peyer's Patch i tunntarmen där DCs tar upp survivinproteinet genom fagocytos och presenterar dem på sina ytreceptorer till naiva CD8+ T-celler (oinaktiverade CTL) för att uppnå ett specifikt immunsvar uteslutande inriktat på survivin. Aktiverade CTL: er specifika för ett visst antigen dödar deras målceller genom att först känna igen delar av survivinproteinet uttryckt på MHC I (immunohistokompatibilitet) proteiner som presenteras på ytan av tumörceller och vaskulatur och sedan frisätter granuler som inducerar tumörcellerna att genomgå apoptos. DNA-vaccinet innehöll CCL21-sekretorisk kemokin som ett sätt att öka sannolikheten för att framkalla immunsvaret genom att bättre förmedla den fysiska interaktionen mellan de antigenpresenterande DCs och de naiva CD8+ T-cellerna, vilket resulterar i en större sannolikhet för immunaktivering.

Resveratrol-medierad sensibilisering

Det har visats av Fulda et al. att den naturligt förekommande föreningen resveratrol (en polyfenol som finns i vindruvor och rött vin) kan användas som ett sensibiliseringsmedel för läkemedelsinducerad apoptos mot cancer genom verkan att orsaka cellcykelstopp. Detta cellcykelstopp orsakar en dramatisk minskning av survivinnivåerna i cellerna, eftersom det är känt från litteraturen att survivinexpression är starkt kopplat till cellcykelns fastillstånd. Således skulle minskningen av survivin, som är en bidragande faktor till kemoterapiresistens och apoptosinduktionsterapier, göra cancercellerna mer benägna för sådana cancerbehandlingar. Fulda et al. har visat fördelarna med resveratrol genom en serie experiment. Först testade författarna till artikeln de inneboende cytotoxiska effekterna av resveratrol. De fann att det inducerade måttliga apoptosnivåer endast i SHEP neuroblastomceller. Därefter testade de resveratrol i kombination med flera olika kända anticancermedel. De fann en konsekvent ökning av nivån av apoptos inducerad av läkemedlen när resveratrol också var närvarande. Dessutom varierade de i vilken ordning antingen läkemedlen eller resveratrol introducerades till cancercellerna för att avgöra om behandlingssekvensen hade någon viktig effekt. Det visade sig att de högsta nivåerna av apoptosinduktion observerades när resveratrol tillsattes före anticancerläkemedelsbehandling. Därefter testade författarna för eventuell differentiell känslighet för apoptos kopplad till fasen av cellcykeln som cellerna befann sig i. Analys med flödescytometri avslöjade en ackumulering av celler i S-fas vid behandling med resveratrol. Cellerna stoppades också i olika faser av cellcykeln med hjälp av speciella föreningar och behandlades sedan med anticancerläkemedlen. De fann att celler som stannade i S-fasen var betydligt mer känsliga för läkemedlens cytotoxiska effekter.

För att bestämma inblandningen av survivin i resveratrol-medierad sensibilisering, beslutade författarna att testa om nedreglering av det specifika survivinproteinuttrycket skulle ge en liknande effekt på fenotypen av resveratrol-behandlade celler. När det gäller att se på vilken nivå resveratrol fungerade, gjorde de en northern blot och fann att resveratrolbehandling resulterade i en minskning av survivin-mRNA-nivåerna, vilket innebär resveratrols hämmande verkan på transkriptionsnivå. För att ytterligare se om survivin spelade en nyckelroll i sensibilisering av cancercellerna för cytotoxiska läkemedel, användes survivin-antisensoligonukleotider för att slå ner eventuellt survivin-mRNA, och därmed elimineras även dess möjlighet att översättas. siRNA för survivin är komplement i sekvens till mRNA-sekvensen som kodar för survivin. När dessa siRNA för survivin introduceras i celler, kommer de att binda till respektive komplementär mRNA och därmed förhindra dess translation eftersom mRNA nu hindras från korrekt fysisk interaktion med translationsmaskineriet. På detta sätt nedreglerar siRNA för survivin effektivt survivin-uttrycksnivån i cellen. Celler behandlade med antisens-oligonukleotider för survivin visade liknande sensibilisering för cellgifter som celler behandlade med resveratrol, vilket ger stöd för resveratrols verkningsmekanism.

Prostatacancer

Det har observerats att utvecklingen av hormonresistens vid prostatacancer kan bero på uppregleringen av antiapoptotiska gener, varav en är survivin.

Zhang et al. hypotesen att om survivin är en betydande bidragsgivare till utvecklingen av hormonbehandlingsresistens i prostatacancerceller, inriktning på survivin och blockering av det skulle öka prostatacancercellers mottaglighet för anti-androgenterapi. (Anti-androgenterapi använder läkemedel för att eliminera närvaron av androgener i cell- och cellmiljön, eftersom sådana androgener är kända för att öka tumörodödligheten i prostatacancerceller.) Zhang et al. först bedömde nivån av survivin-uttryck av LNCaP (en androgenberoende prostatacancercellinje som uttrycker intakta androgenreceptorer) med hjälp av kvantitativ västerländsk analys och fann högt uttryck av survivin i dessa celler. Celler exponerade för dihydrotestosteron (DHT), ett exogent androgen, visade ökade nivåer av endast survivin och inte andra IAP-familjemedlemmar. Detta resultat tyder på att androgener kan uppreglera survivin, vilket bidrar till resistensen mot apoptos som observeras i tumörcellerna. Därefter, med tillsatsen av flutamid (en antiandrogen) till cellerna, observerades survivinnivåerna signifikant minska. LNCaP-cellerna transducerades separat med de olika konstruktionerna av survivingenen (mutant eller vildtyp) och utsattes för flutamidbehandling och utvärderades för apoptosnivån. Flutamid-behandlade survivin-mutant-transducerade celler visades signifikant öka apoptos med dubbelt så mycket som enbart flutamidbehandling. Å andra sidan visade sig överuttryck av vildtypssurvivin signifikant minska apoptosnivåerna från flutamidbehandling jämfört med enbart flutamidbehandling. Därför stöder dessa resultat hypotesen att survivin spelar en roll i den anti-apoptotiska naturen hos LNCaP-cancercellinjen och att inhibering av survivin i prostatacancerceller verkar förstärka den terapeutiska effekten av flutamid.

Interaktioner

Survivin har visat sig interagera med:

Vidare läsning

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Survivin&oldid=1143724293 "