Sackaros gap

Sackarosgaptekniken används för att skapa ett ledningsblock i nerv- eller muskelfibrer . En hög koncentration av sackaros appliceras på det extracellulära utrymmet, vilket förhindrar korrekt öppning och stängning av natrium- och kaliumkanaler , vilket ökar motståndet mellan två grupper av celler. Den utvecklades ursprungligen av Robert Stämpfli för att registrera aktionspotentialer i nervfibrer och är särskilt användbar för att mäta irreversibla eller mycket varierande farmakologiska modifieringar av kanalegenskaper eftersom obehandlade membranregioner kan dras in i noden mellan sackarosregionerna .

Historia

Sackarosgaptekniken introducerades först av Robert Stämpfli 1954 som arbetade med Alan Hodgkin och Andrew Huxley mellan 1947 och 1949. Från sin forskning fastställde Stämpfli att strömmar som rör sig längs nervfibrer kan mätas lättare när det finns ett gap av högt motstånd som minskar mängden ledande medium utanför cellen. Stämpfli observerade många problem med de sätt som användes för att mäta membranpotential på den tiden. Han experimenterade med en ny metod som han kallade sackarosgapet. Metoden användes för att studera aktionspotentialer i nervfibrer.

Huxley observerade Stämpflis metod och höll med om att den var användbar och gav väldigt få fel. Sackarosgaptekniken bidrog också till Stämpflis och Huxleys upptäckt av hämmande kopplingspotentialer. Sedan dess introduktion har många förbättringar och förändringar gjorts av tekniken. En modifiering av metoden för enkelsackarosgap introducerades av CHV Hoyle 1987. Tekniken med dubbla sackarosgap, som först användes av Rougier, Vassort och Stämpfli för att studera hjärtceller 1968, förbättrades av C. Leoty och J. Alix som introducerade en förbättrad kammare för det dubbla sackarosgapet med spänningsklämteknik som eliminerade externt motstånd från noden.

Metod

En klassisk sackarosgapteknik är vanligtvis inrättad med tre kammare som var och en innehåller ett segment av neuronen eller cellerna som studeras. Testkammaren innehåller en fysiologisk lösning, såsom Krebs eller Ringers lösning , som efterliknar jonkoncentrationen och det osmotiska trycket i cellens naturliga miljö. Testläkemedel kan också läggas till denna kammare för att studera effekten som de har på cellulär funktion. Ag-AgCl- eller platinatrådelektroder används vanligtvis för att stimulera cellerna i testlösningen. Sackaroskammaren (eller gapet) är den mittersta kammaren som separerar de två andra kamrarna, eller delar av nervfibern eller cellerna. Denna kammare innehåller en isoton sackaroslösning med hög specifik resistens . Specifik resistans beskriver förmågan hos ett material eller en lösning att motverka elektrisk ström, så en sackaroslösning med en hög specifik resistans är effektiv för att elektriskt isolera de tre kamrarna. Den tredje kammaren innehåller vanligtvis en KCl-lösning som efterliknar den intracellulära lösningen. Den höga kaliumkoncentrationen i denna kammare depolariserar det nedsänkta segmentet av vävnaden, vilket gör det möjligt att mäta potentialskillnader mellan de två segmenten åtskilda av sackarosgapet. Vaselin, kiselfett eller en kisel-vaselinblandning används för att täta nerven eller vävnaden på plats och förhindra diffusion av lösning mellan kamrarna. Ett par agarbryggade Ag-AgCl-elektroder placeras i test- och KCl-kamrarna för att registrera förändringarna i membranpotential.

Enkel sukrosgapteknik

Tekniken för enstaka sackarosgap används för att studera cellers elektriska aktivitet. Det är användbart vid studiet av små nervfibrer och elektriskt anslutna celler såsom glatta muskelceller. Metoden skapar ledningsblock i en nerv- eller muskelfiber genom att införa ett gap med högt motstånd mellan två grupper av celler. En nonjonisk sackaroslösning används för att öka motståndet i det extracellulära området mellan de två grupperna. Detta gör att all ström som har sitt ursprung på ena sidan av gapet kan flöda till den andra sidan endast genom det inre av nerven eller vävnaden. Förändringar i elektrisk potential mellan de två grupperna i förhållande till varandra kan mätas och registreras.

Dubbel sukrosgapteknik

Ändringar har gjorts i tekniken för enkelsackarosgap. En modifiering kallas dubbelsackarosgaptekniken. Detta används för att mäta resistans och membranpotential samtidigt. Två kammare som innehåller sackaroslösningar används för att isolera en nod av nerven eller vävnaden, som är nedsänkt i en fysiologisk lösning. De två ändarna av nerven eller vävnaden depolariseras av en lösning rik på kaliumjoner. Potentialskillnaderna mellan noden, eller testkammaren, och en av de kaliumrika kamrarna kan mätas, medan potentialen i noden kan modifieras av strömmen som degenereras mellan den andra kaliumrika kammaren och noden. Informationen som erhålls kan användas, tillsammans med Ohms lag- ekvation, för att bestämma membranresistansen hos cellerna i noden. Det dubbla sackarosgapet kan också användas som en spänningsklämma. När det används med rätt elektronik kan det dubbla sackarosgapet användas för att spänningsklämma membranpotentialen hos nerv- eller vävnadssegmentet som finns i testkammaren.

Fördelar och begränsningar

Fördelar

Sackarosgaptekniken gör att jonströmmar kan mätas i flercelliga vävnader. Även om spänningsklämma och patchclamp också är effektiva för att studera neurons funktioner, är sackarosgaptekniken lättare att utföra och billigare. Dessutom kan sukrosgaptekniken ge stabila inspelningar från små celler, såsom nervfibrer eller glatta muskelceller, under en längre tid. Det är dock mycket komplicerat att uppnå liknande mätningar med intracellulära eller patch-clamp-elektroder eftersom de fysiskt kan skada små axoner eller celler. På grund av arrangemanget av sackarosgapkamrarna är tekniken för att stimulera neuronen eller cellen enkel och tillförlitlig. Denna metod är också användbar för att studera förändringar i membranpotential som svar på olika farmakologiskt aktiva medel, som kan införas i testkammaren.

Begränsningar

En stor begränsning av det enda sackarosgapet är att det inte kan bestämma de verkliga värdena för membranpotentialen och aktionspotentialamplituderna. Den kan bara mäta de relativa förändringarna i potentialen mellan de regioner som separeras av sackaroslösningen på grund av shunteffekten . Dubbla sackarosgap kan dock mäta membranpotentialen och motståndet. En annan begränsning är att membranpotentialer inte kan erhållas från vävnader där det inte finns någon elektrisk koppling mellan cellerna (dvs när den rumsliga konstanten, λ, är nära noll). Dessutom kan sackaroslösningen, som har en låg jonkoncentration, tömma de exponerade cellerna på vitala intracellulära joner som natrium och kalium, vilket kan påverka deras livsduglighet. Detta kan göra att membranet blir hyperpolariserat och påverka ledningen av aktionspotentialer längs cellen. Trots dessa begränsningar gör de många fördelarna med sackarosgapmetoden den till en användbar och pålitlig teknik i neurovetenskapliga studier.

Ansökningar

Sackaros-gap-tekniken används för att registrera membranaktiviteter från myeliniserade nerver, omyeliniserade nerver, glatt muskulatur och hjärtmuskel. Tillsammans med mikroelektrodmetoder och patch-clamp -metoder används sackarosgapet ofta av experimentörer för att studera nervsystemet och kan fungera som en effektiv metod för att undersöka läkemedels effekter på membranaktiviteter . Studier av effekterna av kolin , acetylkolin och karbakol på vilopotentialen hos det överlägsna cervikala gangliet hos kaniner utfördes med användning av sackaros-gap-metoden. Registreringen av membranpotentialer i det överlägsna cervikala gangliet gjordes enkelt med sackaros-gap-metoden eftersom det möjliggör separerad depolarisering av gangliet och den inre halsnerven.

Sackaros-gap-tekniken har använts för att bestämma förhållandet mellan extern kaliumkoncentration och membranpotentialen hos glatta muskelceller med hjälp av urinledare från marsvin. Det har också använts för att korrigera felaktiga membranpotentialmätningar som är ett resultat av läckströmmar genom membranet och extracellulärt motstånd. Korrigering av en felaktig membranströmavläsning är också möjlig genom användning av sackaros-gap-metoden.

Utvecklingen av sackaros-gap-metoden har lett till dubbla sackaros-gap-tekniker. Ett dubbelt sackaros-gap är generellt fördelaktigt när det används för att elektriskt isolera mindre segment av nervfibrer än vad som skulle vara möjligt med ett enda sackaros-gap, vilket gjordes i studier på membranpotentialer och strömmar i får- och kalvventrikulära muskelfibrer . Den dubbla sackaros-gap-tekniken används också över det enda sackaros-gapet för att studera hjärtmuskeln, där den möjliggör tydligare upplösning av tidiga strömmar, de som inträffar inom de första 10-100 millisekunderna av depolarisering.