Lappklämma
Patch clamp-tekniken är en laboratorieteknik inom elektrofysiologi som används för att studera jonströmmar i enskilda isolerade levande celler, vävnadssektioner eller fläckar av cellmembran. Tekniken är särskilt användbar vid studiet av exciterbara celler som neuroner , kardiomyocyter , muskelfibrer och betaceller från bukspottkörteln , och kan även användas för studiet av bakteriella jonkanaler i speciellt framställda jättesfäroplaster .
Lappklämning kan utföras med spänningsklämteknik . I detta fall kontrolleras spänningen över cellmembranet av experimentatorn och de resulterande strömmarna registreras. Alternativt kan den nuvarande klämtekniken användas. I det här fallet kontrolleras strömmen som passerar över membranet av försöksledaren och de resulterande förändringarna i spänningen registreras, vanligtvis i form av aktionspotentialer .
Erwin Neher och Bert Sakmann utvecklade lappklämman i slutet av 1970-talet och början av 1980-talet. Denna upptäckt gjorde det möjligt att för första gången registrera strömmarna hos en jonkanalmolekyler, vilket förbättrade förståelsen för kanalers inblandning i grundläggande cellprocesser som aktionspotentialer och nervaktivitet. Neher och Sakmann fick Nobelpriset i fysiologi eller medicin 1991 för detta arbete.
Grundläggande teknik
Uppstart
Under en patch clamp-inspelning bringas ett ihåligt glasrör känt som en mikropipett eller patchpipett fylld med en elektrolytlösning och en inspelningselektrod ansluten till en förstärkare i kontakt med membranet i en isolerad cell . En annan elektrod placeras i ett bad som omger cellen eller vävnaden som referensjordelektrod . En elektrisk krets kan bildas mellan inspelnings- och referenselektroden med cellen av intresse däremellan.
Lösningen som fyller patchpipetten kan matcha den joniska sammansättningen av badlösningen, som i fallet med cellfäst inspelning, eller matcha cytoplasman, för helcellsinspelning. Lösningen i badlösningen kan matcha den fysiologiska extracellulära lösningen, cytoplasman, eller vara helt icke-fysiologisk, beroende på experimentet som ska utföras. Forskaren kan också ändra innehållet i badlösningen (eller mindre vanligt pipettlösningen) genom att tillsätta joner eller läkemedel för att studera jonkanalerna under olika förhållanden.
Beroende på vad forskaren försöker mäta kan diametern på pipettspetsen som används variera, men den är vanligtvis inom mikrometerområdet . Denna lilla storlek används för att omsluta en cellmembranyta eller "lapp" som ofta innehåller bara en eller några få jonkanalmolekyler. Denna typ av elektrod skiljer sig från den "skarpa mikroelektroden" som används för att punktera celler i traditionella intracellulära inspelningar , genom att den är förseglad på ytan av cellmembranet, snarare än att föras in genom den.
I vissa experiment värms mikropipettspetsen i en mikrosmedja för att producera en slät yta som hjälper till att bilda en tätning med hög motståndskraft mot cellmembranet. För att få denna tätning med hög motståndskraft pressas mikropipetten mot ett cellmembran och sug appliceras. En del av cellmembranet sugs in i pipetten, vilket skapar ett omegaformat område av membranet som, om det formas på rätt sätt, skapar ett motstånd i intervallet 10–100 gigaohm , kallat en "gigaohm-tätning" eller "gigaseal". Den höga resistansen hos denna tätning gör det möjligt att elektroniskt isolera strömmarna som mäts över membranet med lite konkurrerande brus , samt att ge viss mekanisk stabilitet till inspelningen.
Inspelning
Många patch clamp-förstärkare använder inte kretsar för äkta spänningsklämma , utan är istället differentialförstärkare som använder badelektroden för att ställa in nollström (jord) nivån. Detta gör det möjligt för en forskare att hålla spänningen konstant samtidigt som den observerar förändringar i strömmen . För att göra dessa inspelningar jämförs patchpipetten med jordelektroden. Ström injiceras sedan i systemet för att upprätthålla en konstant inställd spänning. Strömmen som behövs för att klämma fast spänningen är motsatt i tecken och lika stor som strömmen genom membranet.
Alternativt kan cellen strömklämmas i helcellsläge, hålla strömmen konstant samtidigt som förändringar i membranspänningen observeras .
Variationer
Flera varianter av den grundläggande tekniken kan tillämpas, beroende på vad forskaren vill studera. Teknikerna inifrån och ut och ut och ut kallas "excised patch"-tekniker, eftersom plåstret klipps ut (borttaget) från cellens huvudkropp. Cell-fästa och båda excised patch-tekniker används för att studera beteendet hos enskilda jonkanaler i den sektion av membranet som är fäst vid elektroden.
Helcellsplåster och perforerad patch tillåter forskaren att studera hela cellens elektriska beteende, istället för enkanalsströmmar. Helcellsplåstret, som möjliggör elektrisk åtkomst med låg resistans till insidan av en cell, har nu till stor del ersatt mikroelektrodinspelningstekniker med hög resistans för att registrera strömmar över hela cellmembranet.
Cellfäst plåster
För denna metod förseglas pipetten på cellmembranet för att erhålla en gigaseal (en tätning med elektriskt motstånd i storleksordningen en gigaohm), samtidigt som man säkerställer att cellmembranet förblir intakt. Detta möjliggör registrering av strömmar genom enstaka, eller ett fåtal, jonkanaler som finns i membranet som fångas upp av pipetten. Genom att endast fästa på utsidan av cellmembranet blir det väldigt lite störning av cellstrukturen. Dessutom, genom att inte störa det inre av cellen, kommer alla intracellulära mekanismer som normalt påverkar kanalen fortfarande att kunna fungera som de skulle fysiologiskt. Med den här metoden är det också relativt enkelt att få rätt konfiguration, och när den väl erhållits är den ganska stabil.
För ligandstyrda jonkanaler eller kanaler som moduleras av metabotropa receptorer , inkluderas vanligtvis neurotransmittorn eller läkemedlet som studeras i pipettlösningen, där det kan interagera med vad som tidigare var membranets yttre yta . Den resulterande kanalaktiviteten kan tillskrivas läkemedlet som används, även om det vanligtvis inte är möjligt att sedan ändra läkemedelskoncentrationen inuti pipetten. Tekniken är således begränsad till en punkt i en dosresponskurva per plåster. Därför åstadkoms dosresponsen med användning av flera celler och plåster. Spänningsstyrda jonkanaler kan emellertid spännas in successivt vid olika membranpotentialer i en enda patch. Detta resulterar i kanalaktivering som en funktion av spänning, och en komplett IV (ström-spänning) kurva kan upprättas i endast en patch. En annan potentiell nackdel med denna teknik är att, precis som cellens intracellulära vägar inte störs, kan de inte heller modifieras direkt.
Plåster inifrån och ut
I metoden inifrån och ut fästs en lapp av membranet på lapppipetten, lossad från resten av cellen, och den cytosoliska ytan av membranet exponeras för det externa mediet, eller badet. En fördel med denna metod är att försöksledaren har tillgång till membranets intracellulära yta via badet och kan förändra den kemiska sammansättningen av vad membranets insida utsätts för. Detta är användbart när en experimentator vill manipulera miljön vid den intracellulära ytan av enstaka jonkanaler. Till exempel kan kanaler som aktiveras av intracellulära ligander sedan studeras genom en rad ligandkoncentrationer.
För att uppnå konfigurationen inifrån och ut fästs pipetten till cellmembranet som i cellfäst läge, vilket bildar en gigaseal, och dras sedan tillbaka för att bryta av en membranfläck från resten av cellen. Att dra av ett membranplåster resulterar ofta initialt i att det bildas en vesikel av membran i pipettspetsen, eftersom ändarna av plåstrets membran snabbt smälter samman efter excision. Den yttre ytan av vesikeln måste sedan brytas upp för att gå in i inifrån-ut-läge; detta kan göras genom att kort ta membranet genom gränsytan mellan badlösning och luft, genom exponering för en lösning med låg Ca 2+ eller genom att tillfälligt få kontakt med en droppe paraffin eller en bit härdad silikonpolymer .
Helcellsinspelning eller helcellspatch
Helcellsinspelningar involverar inspelning av strömmar genom flera kanaler samtidigt, över ett stort område av cellmembranet. Elektroden lämnas på plats på cellen, som i cellfästa inspelningar, men mer sug appliceras för att spränga membranplåstret, vilket ger åtkomst från det inre av pipetten till cellens intracellulära utrymme . Detta ger ett sätt att administrera och studera hur behandlingar (t.ex. läkemedel) kan påverka celler i realtid. När pipetten är fäst vid cellmembranet finns det två metoder för att bryta plåstret. Den första är genom att applicera mer sug. Mängden och varaktigheten av detta sug beror på typen av cell och storleken på pipetten. Den andra metoden kräver att en stor strömpuls skickas genom pipetten. Hur mycket ström som tillförs och pulsens varaktighet beror också på typen av cell. För vissa typer av celler är det bekvämt att tillämpa båda metoderna samtidigt för att bryta plåstret.
Fördelen med inspelning av lappklämmor i hela celler jämfört med inspelning med skarp elektrodteknik är att den större öppningen vid spetsen av lappklämmans elektrod ger lägre motstånd och därmed bättre elektrisk åtkomst till insidan av cellen. En nackdel med denna teknik är att eftersom elektrodens volym är större än cellens volym kommer det lösliga innehållet i cellens inre långsamt att ersättas av innehållet i elektroden. Detta kallas elektroden som "dialyserar" cellens innehåll. Efter ett tag kommer alla egenskaper hos cellen som beror på lösligt intracellulärt innehåll att förändras. Pipettlösningen som används approximerar vanligtvis miljön med hög kalium i cellens inre för att minimera eventuella förändringar som detta kan orsaka. Det finns ofta en period i början av en helcellsregistrering då man kan göra mätningar innan cellen har dialyserats.
Utvändigt plåster
Namnet "outside-out" understryker både denna tekniks komplementaritet till insidan-ut-tekniken, och det faktum att den placerar cellmembranets yttre snarare än intracellulära yta på utsidan av membranet, i förhållande till patchelektroden. .
Bildandet av en extern patch börjar med en helcellsinspelningskonfiguration. Efter att helcellskonfigurationen har formats, dras elektroden långsamt tillbaka från cellen, vilket tillåter en membrankula att blåsa ut från cellen. När elektroden dras tillräckligt långt bort, kommer denna fläck att lossna från cellen och formas som ett konvext membran på änden av elektroden (som en kula som är öppen vid elektrodspetsen), med den ursprungliga utsidan av membranet vänd utåt från elektrod. Som bilden till höger visar betyder det att vätskan inuti pipetten kommer att simulera den intracellulära vätskan, medan en forskare är fri att flytta pipetten och blåsan med dess kanaler till ett annat bad av lösning. Även om flera kanaler kan existera i en membranblåsa, är inspelningar av en enda kanal också möjliga i denna konformation om membranet av lossnat membran är liten och bara innehåller en kanal.
Outside-out patching ger försöksledaren möjlighet att undersöka egenskaperna hos en jonkanal när den isoleras från cellen och exponeras successivt för olika lösningar på den extracellulära ytan av membranet. Försöksledaren kan perfusera samma plåster med en mängd olika lösningar på relativt kort tid, och om kanalen aktiveras av en signalsubstans eller läkemedel från det extracellulära ansiktet kan en dos- responskurva sedan erhållas. Denna förmåga att mäta ström genom exakt samma bit av membranet i olika lösningar är den distinkta fördelen med det yttre plåstret i förhållande till den cellfästa metoden. Å andra sidan är det svårare att genomföra. Den längre bildningsprocessen involverar fler steg som kan misslyckas och resulterar i en lägre frekvens av användbara plåster.
Perforerad lapp
Denna variant av patch clamp-metoden är mycket lik helcellskonfigurationen. Den största skillnaden ligger i det faktum att när försöksledaren bildar gigaohm-tätningen, används inte sug för att spränga lappmembranet. Istället innehåller elektrodlösningen små mängder av ett svampdödande eller antibiotiskt medel, såsom amfotericin-B , nystatin eller gramicidin , som diffunderar in i membranplåstret och bildar små porer i membranet, vilket ger elektrisk tillgång till cellens inre. När man jämför helcells- och perforerade plåstermetoder kan man tänka sig helcellsplåster som en öppen dörr, där det sker ett fullständigt utbyte mellan molekyler i pipettlösningen och cytoplasman. Den perforerade lappen kan liknas vid en skärmdörr som endast tillåter utbyte av vissa molekyler från pipettlösningen till cellens cytoplasma.
Fördelarna med den perforerade patchmetoden, i förhållande till helcellsregistreringar, inkluderar egenskaperna hos antibiotikumporerna, som tillåter jämvikt endast av små monovalenta joner mellan patchpipetten och cytosolen, men inte av större molekyler som inte kan tränga igenom porerna. Denna egenskap upprätthåller endogena nivåer av tvåvärda joner såsom Ca 2+ och signalmolekyler såsom cAMP . Följaktligen kan man ha inspelningar av hela cellen, som i helcellsplåster, samtidigt som man behåller de flesta intracellulära signaleringsmekanismer, som i cellanslutna inspelningar. Som ett resultat av detta minskar strömavbrottet och stabila perforerade patchinspelningar kan pågå längre än en timme. Nackdelar inkluderar ett högre åtkomstmotstånd, i förhållande till helcell, på grund av att det partiella membranet upptar spetsen av elektroden. Detta kan minska strömupplösningen och öka inspelningsbruset. Det kan också ta en betydande tid för antibiotikan att perforera membranet (cirka 15 minuter för amfotericin-B och ännu längre för gramicidin och nystatin). Membranet under elektrodspetsen försvagas av perforeringarna som bildas av antibiotikan och kan brista. Om plåstret brister, är inspelningen sedan i helcellsläge, med antibiotika som förorenar insidan av cellen.
Lös lapp
En lös lappklämma skiljer sig från de andra teknikerna som diskuteras här genom att den använder en lös tätning (lågt elektriskt motstånd) snarare än den täta gigasätningen som används i den konventionella tekniken. Denna teknik användes så tidigt som år 1961, som beskrivs i en artikel av Strickholm om impedansen av en muskelcells yta, men fick lite uppmärksamhet förrän den togs upp igen och fick ett namn av Almers, Stanfield och Stühmer 1982, efter att patch clamp hade etablerats som ett viktigt verktyg för elektrofysiologi.
För att uppnå en lös lappklämma på ett cellmembran, flyttas pipetten långsamt mot cellen, tills det elektriska motståndet i kontakten mellan cellen och pipetten ökar till ett par gånger större motstånd än det för enbart elektroden. Ju närmare pipetten kommer membranet, desto större motstånd blir pipettspetsen, men om det bildas för nära en tätning, kan det bli svårt att ta bort pipetten utan att skada cellen. För tekniken med lösa lappar kommer pipetten inte tillräckligt nära membranet för att bilda en gigaseal eller en permanent anslutning, och inte heller för att tränga igenom cellmembranet. Cellmembranet förblir intakt, och avsaknaden av en tät försegling skapar ett litet gap genom vilket joner kan passera utanför cellen utan att komma in i pipetten.
En betydande fördel med den lösa förseglingen är att pipetten som används upprepade gånger kan tas bort från membranet efter inspelning, och membranet kommer att förbli intakt. Detta tillåter upprepade mätningar på en mängd olika platser på samma cell utan att förstöra membranets integritet. Denna flexibilitet har varit särskilt användbar för forskare för att studera muskelceller då de drar ihop sig under verkliga fysiologiska förhållanden, erhåller inspelningar snabbt och gör det utan att ta till drastiska åtgärder för att stoppa muskelfibrerna från att dras ihop. En stor nackdel är att motståndet mellan pipetten och membranet reduceras avsevärt, vilket gör att ström kan läcka genom tätningen och avsevärt minskar upplösningen av små strömmar. Detta läckage kan dock delvis korrigeras för, vilket ger möjlighet att jämföra och kontrastera inspelningar gjorda från olika områden på cellen av intresse. Med tanke på detta har det uppskattats att lösa lapptekniken kan lösa strömmar mindre än 1 mA/cm 2 .
Patch-Seq
En kombination av cellulär avbildning, RNA-sekvensering och patchclamp denna metod används för att helt karakterisera neuroner över flera modaliteter. Eftersom neurala vävnader är en av de mest transkriptomiskt olika populationerna av celler , är det en stor utmaning för neuroforskare att klassificera neuroner i celltyper för att förstå kretsarna de bildar. Att kombinera klassiska klassificeringsmetoder med encells-RNA-sekvensering post-hoc har visat sig vara svårt och långsamt. Genom att kombinera flera datamodaliteter som elektrofysiologi , sekvensering och mikroskopi tillåter Patch-seq att neuroner kan karakteriseras på flera sätt samtidigt. Det lider för närvarande av låg genomströmning i förhållande till andra sekvenseringsmetoder främst på grund av det manuella arbetet som är involverat i att uppnå en framgångsrik patch-clamp-inspelning på en neuron. Undersökningar pågår för närvarande för att automatisera patch-clamp-teknik som också kommer att förbättra genomströmningen av patch-seq.
Automatisk lappklämning
Automatiserade patchclamp- system har utvecklats för att samla in stora mängder data billigt på kortare tid. Sådana system inkluderar vanligtvis en engångsmikrofluidisk enhet, antingen ett formsprutat eller ett polydimetylsiloxan (PDMS) gjutet chip, för att fånga en cell eller celler, och en integrerad elektrod .
I en form av ett sådant automatiserat system används en tryckskillnad för att tvinga cellerna som studeras att dras mot pipettöppningen tills de bildar en gigaseal. Sedan, genom att kort exponera pipettspetsen för atmosfären, spricker den del av membranet som sticker ut från pipetten, och membranet är nu i insidan och ut-konformationen, vid pipettens spets. I ett helt automatiserat system kan pipetten och membranplåstret sedan snabbt flyttas genom en serie olika testlösningar, vilket gör att olika testföreningar kan appliceras på den intracellulära sidan av membranet under inspelning.
Se även
externa länkar
- Alternativa bilder för patchclamp-varianter
- Animation av Patch Clamp-metoden Arkiverad 2017-01-30 på Wayback Machine
| Myndighetskontroll : Nationella bibliotek |
|---|
