Patch-sekvensering

Patch-sequencing (patch-seq) är en metod utformad för att ta itu med specifika problem som är involverade i att karakterisera neuroner . Eftersom neurala vävnader är en av de mest transkriptomiskt olika populationerna av celler , är det en stor utmaning för neuroforskare att klassificera neuroner i celltyper för att förstå kretsarna de bildar. Att kombinera klassiska klassificeringsmetoder med encells-RNA-sekvensering post-hoc har visat sig vara svårt och långsamt. Genom att kombinera flera datamodaliteter som elektrofysiologi , sekvensering och mikroskopi tillåter Patch-seq att neuroner kan karakteriseras på flera sätt samtidigt. Det lider för närvarande av låg genomströmning i förhållande till andra sekvenseringsmetoder främst på grund av det manuella arbetet som är involverat i att uppnå en framgångsrik patch-clamp-inspelning på en neuron. Undersökningar pågår för närvarande för att automatisera patch-clamp-teknik som också kommer att förbättra genomströmningen av patch-seq.

Patch-Seq-diagram som illustrerar de tre huvuddatatyperna vi får från tekniken: Elektrofysiologiska egenskaper, transkriptomanalys och morfologisk rekonstruktion.

Bakgrund

Historik av patch clamp

En bild av en pipett som bildar en tätning med en neuronal soma, undertryck appliceras för att bilda giga-ohm tätningen

Patch-seq är en specialiserad form av patch clamp- inspelningstekniken, guldstandarden för elektrofysiologiska encellsstudier för sin millisekundsupplösning av cellulär elektrofysiologi, dess förmåga att detektera strömmar av specifika joner, och kanske viktigast för dess förmåga att bilda en spänning klämma på cellmembranet. Tekniken utvecklades ursprungligen med ett litet glasrör, pipett , som snabbt värms upp och sträcks för att producera en nålliknande form med en öppningsdiameter på 3-5 millimeter. Moderna preparat använder olika spetsdiametrar beroende på den avsedda applikationen. Pipetten fylls med ett saltbad för att leda jonströmmar innan den pressas mot en cellyta för att bilda en elektrisk tätning med ett högt elektriskt motstånd (mätt i enheten ohm ) vilket säkerställer lågt brus i inspelningen. Även om denna tätning kommer att vara av storleksordningen megaohm, har det visat sig att applicering av ett lätt sug kommer att resultera i en tätning med ett motstånd större än en giga-ohm. Tätningen med hög resistans gör att försöksledaren kan hålla membranet i tätningen vid en önskad spänning för att studera spänningsstyrda jonkanaler . Denna förmåga att bilda spänningsklämman på en membranlapp ger tekniken dess namn. Denna klämma är kritisk för att testa spänningsberoende öppningsdynamik för jonkanaler som bestämmer ett membrans vilopotentialer och aktionspotentialer . Pipettlösningen kan också fyllas med specifika joner för att rikta in sig på speciella jonkanaler av intresse såsom natriumkanaler , kaliumkanaler och kalciumkanaler bland många andra. Både Erwin Neher och Bert Sakmann, uppfinnarna av tekniken, vann 1991 års Nobelpris i fysiologi eller medicin för att ha utvecklat patchclamp och använda den för att bevisa existensen av jonkanaler . Att känneteckna jonkanalernas öppningsdynamik har gett avgörande insikter om fysiologiska mekanismer som ligger till grund för en mångfald av tillstånd från neurologiska tillstånd, diabetes och hjärttillstånd. Många medicinska tillstånd är resultatet av en kanalopati , en mutation av en gen som kodar för en jonkanal som stör elektriska fenomen som ligger bakom fysiologiska processer.

Initialt begränsade behovet av direkt kontakt mellan pipetten och cellmembranet patchclamps användning till odlade cellpreparat . Hjärnskivor har skräp, blod- och lymfkärl eller utanför målceller som kan blockera pipetten från sitt mål. Med tiden visade det sig att användningen av enzymatiska lösningar möjliggjorde inspelningar i hjärnskivor också. Neurovetenskap kräver ofta samstämmig observation av elektrofysiologisk dynamik och beteende för att testa sambandet mellan psykologiska teorier och deras underliggande biologi . Att uppnå detta med de ömtåliga glasrören med otroligt tunna spetsar som sträcker sig in i en spets som används för patch-clamp kräver betydande mekanisk stabilisering antingen genom att huvudet fixeras till djuret eller genom att använda en stabiliseringsrigg som är fäst vid djurets huvud. Precis som med preparat för hjärnskivor utanför mål utgör fysiska barriärer också ett problem, och ett problem som inte kan avlägsnas med enzymatiska lösningar. Så småningom övervanns dessa tekniska utmaningar. Den första in vivo -inspelningen gjordes hos sövda katter med huvudfixerade. Risken för att pipettspetsen skulle klämma av målet minskades genom applicering av positivt tryck under införandet eller användning av en rengöringspipett för att säkerställa att huvudförseglingen inte skadades. Så småningom utvidgades dessa tekniker till vakna, huvudfixerade djur och till och med fritt rörliga gnagare. Patch clamp kan användas för att spela in från intilliggande och närliggande celler för att förstå hur små klicker av neuroner ansluter till varandra och studerar undertröskelhändelser.

Patch clamp i jämförelse med andra elektrofysiologiska inspelningstekniker

Medan andra moderna inspelningstekniker såsom multi-electrode array och fluorescerande kalciumsensorer har dykt upp som alternativ som kan spela in från mycket fler neuroner på en gång, erbjuder patch clamp en tidsupplösning i millisekunder och möjligheten att studera specifika jonströmmar. Däremot är den bästa tidsupplösningen som erbjuds av optogenetiska inspelningstekniker i storleksordningen tiotals millisekunder, och på grund av optisk interferens kan den endast användas på strukturer nära ytan eller kräver avlägsnande av mellanliggande strukturer. Också kritiskt patch-clamp erbjuder möjligheten att applicera en spänningsklämma eller en strömklämma på membranet för att bäst karakterisera neuronernas elektriska egenskaper. Ingen annan teknik ger experiment så exakt kontroll över membranpotentialer. Optogenetiska tekniker har ännu inte erbjuda något jämförbart och kommer sannolikt inte att kunna göra det.

Neuronal celltypning kräver samtidig infångning av flera datamodaliteter

Kortikal mikrokrets

Medan en neurons elektriska egenskaper är viktiga när man överväger att definiera en celltyp, är dess morfologi , typer av neurotransmittorer som frigörs, neurotransmittorreceptorer uttryckta vid synapser, såväl som neuronens placering i nervsystemet och dess lokala krets , lika viktiga. Neuroner finns i en enorm mångfald av former med många skillnader i cellkroppar (soma) , dendriter och axoner . Dendriternas position bestämmer vilka andra neuroner en cell får sin input från och deras form kan ha en enorm inverkan på hur en neuron reagerar på denna input. Likaså bestämmer målen för en neuronaxon dess utdata. De typer av synapser som bildas mellan neuronernas axoner och dendriter är lika viktiga. Till exempel i den kortikala mikrokretsen i däggdjursbarken, porträtterad till höger, har celler mycket specifika projektionsmönster både inom den lokala kretsen såväl som för in- och utmatning från och till andra kortikala och icke-kortikala regioner. Dendritisk geometri kan också påverka det elektriska beteendet hos en neuron, och har ett enormt inflytande på hur dendriter bearbetar input i form av postsynaptiska potentialer . Oordnad geometri och projektionsmönster har kopplats till en mångfald av psykiatriska och neurologiska tillstånd inklusive autism och schizofreni även om beteenderelevansen av dessa fenotyper ännu inte är klarlagd. Neuronala celltyper verkade ofta variera kontinuerligt mellan varandra. Tidigare försök till neuronal klassificering av morfo-elektriska egenskaper har begränsats av användningen av inkompatibla metoder och olika cellinjeval.

Med tillkomsten av encellig RNA-sekvensering (scRNA-seq) hoppades man att det skulle existera gener som konsekvent endast skulle uttryckas i neuroner med specifika klassiskt definierade egenskaper. Dessa gener skulle fungera som cellmarkörer. Detta skulle ge ett bättre sätt att avgränsa neurontyper snabbt och enkelt med endast mRNA-sekvensering. Det visade sig dock att scRNA-seq bara tjänade till att förstärka det faktum att alltför stela celltypsdefinitioner inte alltid är det bästa sättet att karakterisera neuroner. Dessutom är genuttryck dynamiskt reglerat, varierande över olika tidsskalor som svar på aktivitet på celltypsspecifika sätt för att möjliggöra neuronal plasticitet. Liksom andra vävnader måste också utvecklingsprocesser beaktas. Att matcha resultat från scRNA-seq till klassiskt definierade neuronala celltyper är mycket utmanande av alla dessa skäl och dessutom encellig RNA-seq har sina egna nackdelar för neuronal klassificering. Medan scRNA-seq möjliggör studiet av genuttrycksmönster från individuella neuroner, stör det vävnaden för individuell cellisolering och därför är det svårt att sluta sig till en neurons ursprungliga position i vävnaden eller observera dess morfologi. Att länka sekvenseringsinformationen till en neuronal subtyp, definierad tidigare av elektrofysiologiska och morfologiska egenskaper är en långsam och komplicerad process. Den samtidiga insamlingen och integrationen av flera datatyper med patch-seq gör den idealisk för neuronal klassificering, avslöjar nya korrelationer mellan genuttryck, elektrofysiologiska och morfologiska egenskaper och neuronal funktion. Detta gör patch-seq till en verkligt tvärvetenskaplig metod som kräver samarbete mellan specialister inom elektrofysiologi, sekvensering och bildbehandling.

Förberedelse och modellsystemval

Patch-seq kan göras i alla modellsystem inklusive cellkultur för neuroner. Neuroner för odling kan samlas in från neuronal vävnad och sedan disassocieras eller tillverkas av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC), neuroner som har odlats ur mänskliga stamcellinjer. Förberedelse av cellodling är det enklaste att applicera patch clamp på och ge försöksledaren kontroll över vilka ligander neuronen utsätts för, till exempel hormoner eller signalsubstanser. Fördelen med total experimentell kontroll innebär dock också att neuronerna inte är föremål för den naturliga miljön de skulle exponeras för under utvecklingen. Som tidigare nämnts är positionen som deras dendriter och axoner sträcker sig in i, liksom neuronens position med en hjärnstruktur, otroligt viktig för att förstå dess roll i en krets. Det finns många preparat för hjärnskivor från olika djurarter. På grund av närvaron av cell eller skräp i vägen för pipetten och en målcell kommer beredningen att behöva modifieras något, ofta appliceras ett lätt positivt tryck på pipetten för att förhindra att oavsiktliga tätningar bildas. Om det är intressant att förstå hur beteendet är kopplat till dynamiken i neuronala händelser är det möjligt att spela in in vivo också. Även om anpassning av lappklämma för in vivo -studier kan vara mycket svårt av mekaniska skäl, särskilt under en beteendeuppgift, men har gjorts. Automatiserade in vivo patchclamp-metoder har utvecklats. Mycket liten skillnad existerar mellan preparat för däggdjursarter även om den större mångfalden av neuronala storlekar i icke-mänskliga primater och primater cortex kan göra det nödvändigt att använda olika spetsdiametrar och tryck för att bilda sälar utan att döda målneuroner. Patch-seq appliceras också på icke-neuronala studier såsom pankreas- eller hjärtceller.

Arbetsflöde för patchsekvensering

Efter att ha valt ett modellsystem och förberedelsetyp har patch-seq-experiment ett liknande arbetsflöde. Först upprättas en tätning mellan cellen och pipetten så att inspelning och uppsamling kan ske. Celler kan fyllas med en fluorescerande etikett för avbildning under inspelning. Efter inspelning appliceras undertryck för att fånga cytosolen och ofta kärnan för sekvensering. Denna process upprepas tills cellerna i beredningen har degraderats och inte är värda att samla in data från. Post-hoc analys av bilddata möjliggör morfologisk rekonstruktion. Likaså krävs ofta komplex post-hoc-bearbetning av transkriptomiska data för att hantera ett stort antal förvirringar vid insamling av cytosoliskt innehåll från celler via pipetten. [1] [2]

Bildar tätningen mellan pipett och cell

Patchpipetten är designad för helcellsinspelning så dess öppningsdiameter är större än experiment som gjorts för att undersöka enstaka jonkanaler. För det mesta kan standardprotokoll för patch clamp användas även om det finns några små situationsberoende modifieringar av pipetten och den interna lösningen. En ännu bredare diameter kan användas för att underlätta aspirationen av insidan av cellen in i pipetten, men den kan behöva justeras baserat på målcellstypen. Negativt tryck appliceras för att förbättra tätningen vilket blir bättre för registrering samt förhindra intracellulärt vätskeläckage och kontaminering efter eller under uppsamling av cellinnehåll för sekvensering. Under inspelning biotin diffundera in i cellen via pipetten för avbildning och senare morfologisk rekonstruktion.

Elektrofysiologisk registrering

När en tätning väl har etablerats utsätts cellerna för olika stimuleringsregimer med hjälp av spänningsklämman, såsom ramper, fyrkantspulser och bullriga ströminjektioner. Funktioner hos cellkroppens membran registreras inklusive vilomembranpotential och tröskelpotential . Egenskaper som observerats från genererade aktionspotentialer (AP) såsom AP-bredd, AP-amplitud, efterdepolarisering och efter-hyperpolarisationsamplitud registreras också. Helcellsinspelningar utförs med hjälp av patch-omkodande pipetter fyllda med en liten volym intracellulär lösning (för att undvika RNA-utspädning), kalciumkelatorer, RNA-bärare och RNas-hämmare. Tillägget av RNas-hämmare, såsom EGTA, förbättrar transkriptomanalys genom att bevara RNA av högre kvalitet från proverna. Inspelningstiden kan ta mellan 1 och 15 minuter utan att påverka neuronstrukturen på grund av svullnad, med lägre värden som ökar genomströmningen av tekniken. Uppgifterna registreras och analyseras med kommersiell eller öppen källkod såsom MIES, PATCHMASTER, pCLAMP, WaveSurfer, bland andra.

Neuroner är förstimulerade för att verifiera sin vilomembranpotential och stabilisera sin baslinje över och inom experiment. Celler stimuleras sedan av ramp- och kvadratströmmar, deras elektrofysiologiska egenskaper registreras och mäts. Efter stimulans måste membranpotentialen återgå till baslinjevärdet för att inspelningarna ska vara konsekventa och robusta. Undertryck används i slutet av inspelningarna för att återställa membranstabiliteten. Mätningar måste uppfylla dessa villkor för att övervägas för vidare analys. Under inspelning måste cellviabiliteten upprätthållas eftersom det är påfrestande för cellen att vara patch-clamped.

Kärnextraktion

Undertryck används för att flytta kärnan nära pipettspetsen samtidigt som elektroden flyttas nära mitten av soma. Modellsystemet i fråga kommer att påverka det undertryck som ska appliceras. Hos mänskliga och icke-mänskliga primater är cellviabiliteten svårare att säkerställa. Större variationer i neuronal storlek jämfört med gnagarmodeller betyder större variation i mängden negativt tryck som behövs för att extrahera cytosolen och kärnan. Efter hämtning dras pipetten långsamt tillbaka samtidigt som undertrycket bibehålls tills membranet som omger kärnan bryter av från cellen med spetsen som bildar en membrantätning. Membranförseglingen fångar innehållet som extraherats i pipetten och förhindrar kontaminering under borttagning för sekvensering innan pipetten förbereds för en annan inspelning. Tätningens konstruktion kan observeras elektriskt genom ökningen av motståndet (MΩ). Hämtningsprocessen är långsam och tar ofta cirka tio minuter, eftersom precision krävs för att inte spränga cellen.

Transkriptomik

RNA-seq- analys utförs med användning av kärnan och cytosolen extraherad från de registrerade neuronerna. RNA amplifieras till fullängds-cDNA och bibliotek konstrueras för sekvensering. Analyser inklusive kärnan har inte bara högre utbyten av mRNA utan har ökad datakvalitet.

Prover uppvisar en hög grad av variation i RNA-innehållet, i vissa fall inklusive RNA-kontamination från intilliggande celler såsom astrocyter eller andra typer av neuroner. Kvaliteten bedöms av definierade markörgener, vilket indikerar om RNA-innehållet inkluderar mål från cellklassen av intresse ( på markör) och saknar föroreningsmarkörer ( offmarkör ). Olika mått används för att bedöma kvaliteten på insamlat RNA.

Normaliserad markörsumma (NMS) poäng: förhållandet mellan på markörgener från patch-seq-cellen i förhållande till medianuttryck av samma gener från en analog data med användning av cellulära dissociationsmetoder såsom fluorescensaktiverad cellsortering ( FACS ). Cellulära dissociationsmetoder har minskat tekniska problem och fungerar som en standardiseringsmetod. Poängen mäter genuttryckslikhetsmönstret från provet till en känd cellklass. Lägre NMS-poäng indikerar en minskad detektion av on -markörgener, mer än en ökning av off- markörgener.
Kontamineringspoäng: Indikerar sannolikheten för RNA-kontamination från nära celler under extraktion. Kontaminering kan uppstå från pipettresor till soma som interagerar med andra neuronala processer. Den beräknas som summan av NMS-poängen från alla breda celltyper som inte matchar den tilldelade cellklassen.
Kvalitetspoäng: Mäter korrelationen mellan on- och off -markörgener från patch-seq-resultatet med den genomsnittliga expressionsprofilen för celler som analyserats med cellulära dissociationsmetoder av samma typ.
Nukleusnärvaromarkörer: Detektion av kärnspecifika gener (som Malat1 hos däggdjur) och ökat förhållande av intronavläsningar ger bevis för kärninkorporering i RNA-sekv-analys.

Morfologisk rekonstruktion

Neuronform och struktur, såsom dendritisk/axonal arborisering, axonal geometri, synaptiska kontakter och soma-lokalisering, används för klassificering av neuronal typ. I akuta skivpreparat eller in vivo noteras den laminära positionen eftersom den också har viktiga funktionella konsekvenser. Färgningen av biotin utförs under neuronelektrofysiologisk inspelning. Alternativt rhodamin tillsatt utanför cellen att föreställa sig den levande cellen före inspelning. Avbildning görs av tvådimensionella sida vid sida bilder genom ljusfältsöverföring och fluorescenskanaler på enskilda celler och bearbetas sedan i kommersiell eller öppen källkod. Högre upplösningsbilder kan erhållas från odlade neuroner i jämförelse med akuta skivor, vilket ger morfologiska rekonstruktioner av högre kvalitet.

Post-hoc 3D-rekonstruktion görs av bildbehandlingsprogram som TReMAP, Mozak eller Vaa3D. Kvaliteten på resultatet beror på en mängd olika faktorer från den elektrofysiologiska inspelningstiden till kärnextraktionsproceduren. Rekonstruerade celler kategoriseras sedan i fyra kvalitetsnivåer beroende på deras integritet och strukturens fullständighet. Hög kvalitet om somas och processer är fullt synliga och korrekt digital rekonstruktion är möjlig, medium kvalitet om somas och vissa processer är synliga men inte är kompatibla med 3D-rekonstruktion, otillräckligt axon där dendriter är fyllda med biotin men axoner är svagt färgade och misslyckade fyllningar som saknar somafärgning troligtvis på grund av att strukturen avtar efter kärnkraftsutvinning.

Nedströms dataanalys

Utformning av arbetsflöde för bearbetning och kombination av resulterande multimodala data beror på den specifika forskningsfrågan patch-seq tillämpas på. I celltypningsstudier bör data jämföras med befintliga scRNA-seq-studier med större provstorlekar (i storleksordningen tusentals celler jämfört med tiotals eller hundratals) och därför större statistisk kraft för celltypsidentifiering med enbart transkriptomiska data. Korrelationsbaserade metoder är tillräckliga för detta steg. Dimensionalitetsreduktionsmetoder såsom T-fördelad stokastisk granninbäddning eller enhetlig grenrörsapproximation och projektion kan sedan användas för visualisering av den insamlade datans position på en referensatlas av högre kvalitet scRNA-seq-data. Maskininlärning kan tillämpas för att relatera genuttrycksdata till morfologiska och elektrofysiologiska data. Metoder för att göra det inkluderar autoencoders , flaskhalsnätverk eller andra metoder för rankningsminskning. Att inkludera morfologiska data har visat sig vara utmanande eftersom det är en datorseendeuppgift , ett notoriskt komplicerat problem inom maskininlärning . Det är svårt att representera bilddata från de morfologiska rekonstruktionerna som en funktionsvektor för att inkludera i analysen.

Ansökningar

Patch-seq integrativ datauppsättning möjliggör en omfattande karakterisering av celltyper, särskilt i neuroner. Neurovetenskapsmän har tillämpat denna teknik på en mängd olika experiment och protokoll för att upptäcka nya cellsubtyper baserat på korrelationer mellan transkriptomiska data och neuronala morfo-elektriska egenskaper. Genom att tillämpa maskininlärning på patch-seq-data är det sedan möjligt att studera transkriptomiska data och koppla dem till deras respektive morfo-elektriska egenskaper. Att ha en bekräftad grundsanning för robust celltypsklassificering tillåter forskare att titta på funktionen hos specifika neurontyper och subtyper i komplexa processer som beteende, språk och de underliggande processerna i neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Jämförelse av proteomik med transkriptomik har visat att transkriptionsdata inte nödvändigtvis översätts till samma proteinuttryck och att det också är viktigt för neurovetenskapen att ha förmågan att titta på grundsanningen av en neurons fenotyp från klassiska klassificeringsmetoder kombinerat med transkriptomiska data. Patch-seq-experiment har hittats som stödjer transkriptomiska resultat, men andra har hittat fall där morfologin för liknande transkriptomiskt definierade celltyper i olika hjärnregioner inte matchade. Tekniken är särskilt väl lämpad för neurovetenskap, men i allmänhet skulle all vävnad där det är av intresse att samtidigt känna till elektrofysiologi, morfologi och transkriptomik hitta användning för patch-seq. Till exempel har patch-seq också applicerats på icke-neuronala vävnader såsom pankreasöar för att studera diabetes.

Patch-Seq-datauppsättningar integrerade i maskininlärningsalgoritmer för att förutsäga neuronmorfologi och elektrofysiologiska egenskaper från transkriptomdata erhållna från encellssekvensering.

Studier av riktade neuronala populationer: Patch-seq utmärker sig jämfört med andra metoder i sin förmåga att mäta och extrahera genetisk information från riktade neuroner utan att behöva störa provet. Detta möjliggör exakt spårning av transkriptomiska data till neuronens egenskaper, såsom dess anslutning, platsen i skivan, morfologi. Korrelationsstudier mellan dessa datatyper hjälper till att identifiera differentiella uttrycksgener över neuronala typer och upptäcka genetiska markörer för snabb klassificering.
Sammanställning och integration av multimodala celltypdatabaser: Patch-seq har använts för att integrera neuronfunktionella egenskaper till de stora transkriptionsdatabaserna från encelliga RNA-seq-studier. Patch-seq kan tillhandahålla elektrofysiologiska och morfologiska data, där morfologi är mindre vanlig på grund av svårigheten att uppnå höga kvalitetsstandarder. Integrering av multimodala data är nödvändig eftersom korrekt märkning av celltyp inte kan erhållas från bara en datatyp. Tidigare forskning har visat att transkriptomiskt likartade neuroner kan ha olika morfo-elektriska egenskaper.
Molekylär grund för morfologisk och funktionell mångfald: Forskning om de molekylära mekanismerna som definierar neurons morfologiska och funktionella mångfald pågår. Patch-seq tillåter identifiering av differentiellt uttryckta gener mellan kända distinkta celltyper. Små förändringar i genuttryck kan få celler att visa ett annat svar på stimuli, vilket understryker vikten av att korrelera dessa data för korrekt klassificering.

Begränsningar

Den allvarligaste begränsningen för patch-seq är en begränsning som delas av patch clamp-tekniker generellt, det är kravet på hög trohet och skickligt manuellt arbete. Lappklämning har beskrivits som en konstform och kräver övning för att fullända tekniken. Så det är inte bara arbetskrävande utan tar också år av träning för att prefektera tekniken. Hittills har den största patch-seq-studien gjorts i akuta kortikala skivor av mus primära visuella cortex . Drygt 4000 neuroner lappades och sekvenserades från och ansträngningen krävde en enorm mängd manuellt arbete. De flesta andra datamängder samlades in från tiotals eller hundratals celler. Betydligt mindre än celler som samlats in för sekvensering genom att dissociera vävnaden. Ändå kan ingen annan elektrofysiologisk inspelningsteknik matcha patch-seqs tidsmässiga upplösning eller förmåga att karakterisera specifika jonströmmar och inte heller erbjuda kapacitet att producera en spänningsklämma. Av dessa skäl är automatisering av tekniken ett område för aktiv undersökning av många laboratorier runt om i världen för tillämpningar som använder patch clamping inklusive patch-seq.

Morfologisk rekonstruktion via digital bildbehandling är en annan begränsning av tekniken med passhastigheter som ofta är lägre än 50 %. Den korrekta integrationen av det enorma antalet bilder med höga mängder brus och den strukturella störningen som orsakas av kärnextraktion gör det till en beräkningsutmaning inom neurovetenskap. Nya automatiska spårningsmetoder utvecklas, men kvaliteten är fortsatt låg.

Framtida inriktningar

Integrering av andra sekvenseringsteknologier, proteomik och encellig genetisk manipulation

Hittills har den enda sekvenseringsteknologin som använts varit mRNA-sekvensering. Att även inkludera andra modaliteter skulle öka antalet " omics " som ingår i de genererade data. Till exempel kan en teknik för att separera mRNA från DNA:t möjliggöra studier av modifieringar på DNA:t. Kromatintillgänglighet kunde bedömas från DNA-metylering och med hjälp av metylerad DNA-immunfällning och histonacetylering och deacetylering från ChIP-sekvensering . Detta skulle möjliggöra studier av epigenetik i patch-seq experiment. Likaså skulle separering av proteiner vara användbart för att bedöma proteinöverflöd som möjliggör integration med proteomik . CRISPR kan inkluderas i pipetten och injiceras under inspelningen för att undersöka effekterna av mutation på encellsnivå.

Automatisk patchning

Den största flaskhalsen för genomströmningen av patch-seq är det arbete som krävs för patchklämning. Långsamt automatiserad lappklämma börjar bli normen men har ännu inte nått bred användning. Detta trots att vissa autopathingriggar har en högre framgångsrikt förseglingshastighet och datainsamlingshastighet än människor. Automatiserad lappklämning kan antingen göras blind utan bildinformation istället för att förlita sig på trycksensorer för att ge input för algoritmer som styr robotriggar för att bilda tätningar och registrera. Alternativt existerar bildstyrda algoritmer också för målinriktning av fluorescensmärkta celler. Vissa system är bättre lämpade för specifika modellsystem och förberedelser. [3]

Se även