Mikrofluidisk cellkultur

Mikrofluidisk cellkultur integrerar kunskap från biologi, biokemi, teknik och fysik för att utveckla enheter och tekniker för att odla, underhålla, analysera och experimentera med celler i mikroskala. Den sammanfogar mikrofluidik , en uppsättning tekniker som används för manipulering av små vätskevolymer (μL, nL, pL) inom artificiellt tillverkade mikrosystem , och cellkultur , som involverar underhåll och tillväxt av celler i en kontrollerad laboratoriemiljö. Mikrofluidik har använts för cellbiologiska studier eftersom dimensionerna på mikrofluidkanalerna är väl lämpade för den fysiska skalan av celler (i storleksordningen 10 mikrometer). Till exempel eukaryota celler linjära dimensioner mellan 10 och 100 μm som faller inom området för mikrofluidiska dimensioner. En nyckelkomponent i mikrofluidisk cellkultur är att kunna efterlikna cellens mikromiljö som inkluderar lösliga faktorer som reglerar cellstruktur, funktion, beteende och tillväxt. En annan viktig komponent för enheterna är förmågan att producera stabila gradienter som är närvarande in vivo eftersom dessa gradienter spelar en betydande roll för att förstå kemotaktiska , durotaktiska och haptaktiska effekter på celler.

Tillverkning

Några överväganden för mikrofluidiska enheter relaterade till cellkultur inkluderar:

Tillverkningsmaterial är avgörande eftersom inte alla polymerer är biokompatibla, med vissa material som PDMS som orsakar oönskad adsorption eller absorption av små molekyler. Dessutom kan ohärdade PDMS-oligomerer läcka in i cellodlingsmediet, vilket kan skada mikromiljön. Som ett alternativ till vanligt använda PDMS har det gjorts framsteg i användningen av termoplaster (t.ex. polystyren) som ersättningsmaterial.

Rumslig organisation av celler i mikroskala enheter beror till stor del på odlingsregionens geometri för celler att utföra funktioner in vivo . Till exempel kan långa, smala kanaler önskas för att odla neuroner . Det valda perfusionssystemet kan också påverka den valda geometrin. Till exempel, i ett system som innehåller sprutpumpar, skulle kanaler för perfusionsinlopp, perfusionsutlopp, avfall och cellladdning behöva läggas till för underhåll av cellodlingen. Perfusion i mikrofluidisk cellkultur är viktig för att möjliggöra långa odlingsperioder på chip och celldifferentiering .

Andra kritiska aspekter för att kontrollera mikromiljön inkluderar: cellsåddstäthet, minskning av luftbubblor eftersom de kan spricka cellmembran, avdunstning av media på grund av en otillräckligt fuktig miljö och cellkulturunderhåll (dvs regelbundna mediabyten i rätt tid).

Cellens hälsa definieras som de kollektiva jämviktsaktiviteterna av väsentliga och specialiserade cellulära processer; medan en cellstressor definieras som en stimulans som orsakar exkursion från dess jämviktstillstånd. Därför kan cellhälsan störas inom mikrosystem baserat på plattformsdesign eller driftsförhållanden. Exponering för stressfaktorer inom mikrosystem kan påverka celler på direkta och indirekta sätt. Därför är det viktigt att designa mikrofluidiksystemet för cellodling på ett sätt som minimerar cellstresssituationer. Till exempel, genom att minimera cellsuspension, genom att undvika abrupta geometrier (som tenderar att gynna bubbelbildning), designa högre och bredare kanaler (för att undvika skjuvspänning), undvika värmekänsliga hydrogeler...

Fördelar

Några av de stora fördelarna med mikrofluidisk cellkultur inkluderar minskade provvolymer (särskilt viktigt när man använder primära celler, som ofta är begränsade) och flexibiliteten att anpassa och studera flera mikromiljöer inom samma enhet. En reducerad cellpopulation kan också användas i ett system i mikroskala (t.ex. några hundra celler) i jämförelse med odlingssystem i makroskala (som ofta kräver 10 5 - 10 7 celler); detta kan göra det lättare att studera vissa cell-cell-interaktioner. Dessa reducerade cellantal gör det lättare att studera icke-delande eller långsamt delande celler (t.ex. stamceller ) än traditionella odlingsmetoder (t.ex. kolvar, petriskålar eller brunnsplattor) på grund av de mindre provvolymerna. Med tanke på de små dimensionerna i mikrofluidik laminärt flöde uppnås, vilket gör att manipulationer med odlingssystemet enkelt kan göras utan att påverka andra odlingskammare. Laminärt flöde är också användbart eftersom det efterliknar vätskedynamik in vivo mer exakt, vilket ofta gör mikroskalakultur mer relevant än traditionella odlingsmetoder. Fackindelade mikrofluidkulturer har också kombinerats med kalciumavbildning av levande celler, där depolariserande stimuli har levererats till de perifera terminalerna av neuroner och kalciumsvar registrerats i cellkroppen. Denna teknik har visat en stark skillnad i känsligheten hos de perifera terminalerna jämfört med den neuronala cellkroppen för vissa stimuli såsom protoner. Detta ger ett utmärkt exempel på varför det är så viktigt att studera de perifera terminalerna isolerat med hjälp av mikrofluidiska cellodlingsanordningar.

Kulturplattformar

Traditionell cellkultur

Traditionell tvådimensionell (2D) cellkultur är cellodling som äger rum på en plan yta, t.ex. botten av en brunnsplatta, och är känd som den konventionella metoden. Även om dessa plattformar är användbara för att växa och passera celler som ska användas i efterföljande experiment, är de inte idealiska miljöer för att övervaka cellsvar på stimuli eftersom celler inte kan röra sig fritt eller utföra funktioner som observerats in vivo som är beroende av interaktioner mellan cell-extracellulär matrismaterial . . För att lösa detta problem har många metoder utvecklats för att skapa en tredimensionell (3D) inbyggd cellmiljö. Ett exempel på en 3D-metod är den hängande droppen, där en droppe med växande celler hänger upp och hänger nedåt, vilket gör att celler växer runt och ovanpå varandra och bildar en sfäroid. Metoden med hängande droppar har använts för att odla tumörceller men är begränsad till en sfärs geometri. Sedan tillkomsten av poly(dimetylsiloxan) (PDMS) har tillverkning av mikrofluidikanordningar genom mjuk litografi utvecklats och har visat sig vara mycket fördelaktiga för att efterlikna en naturlig 3D-miljö för cellodling.

Mikrofluidisk cellkultur

Mikrofluidiska enheter gör det möjligt att studera en enda cell till några hundra celler i en 3D-miljö. Jämförelsevis har makroskopiska 2D-kulturer 10 4 till 10 7 celler på en plan yta. Mikrofluidik tillåter också kemiska gradienter, det kontinuerliga flödet av färska medier, testning med hög genomströmning och direkt utmatning till analytiska instrument. Dessutom öppna mikrofluidiska cellkulturer som "mikrokanaler" för direkt fysisk manipulering av celler med mikropipetter. Många mikrofluidiska system använder användningen av hydrogeler som stöd för extracellulär matris (ECM) som kan moduleras för fibertjocklek och porstorlek och har visats tillåta tillväxt av cancerceller. Gelfria 3D-cellkulturer har utvecklats för att tillåta celler att växa i antingen en celltät miljö eller en ECM-fattig miljö. Även om dessa anordningar har visat sig vara mycket användbara finns det vissa nackdelar som att celler fastnar på PDMS-ytan, små molekyler som diffunderar in i PDMS och oreagerade PDMS-polymerer som tvättar in i cellodlingsmedia.

Användningen av 3D-cellkulturer i mikrofluidiska enheter har lett till ett studieområde som kallas organ-on-a-chip . Den första rapporten om dessa typer av mikrofluidkulturer användes för att studera toxiciteten hos naftalenmetaboliter på levern och lungorna (Viravaidya et al.). Dessa enheter kan odla en avskalad version av ett organliknande system som kan användas för att förstå många biologiska processer. Genom att lägga till en ytterligare dimension kan mer avancerade cellarkitekturer uppnås, och cellbeteende är mer representativt för in vivo- dynamik; celler kan engagera sig i förbättrad kommunikation med närliggande celler och cell-extracellulära matrixinteraktioner kan modelleras. I dessa enheter kan kammare eller kollagenlager som innehåller olika celltyper interagera med varandra i flera dagar medan olika kanaler levererar näringsämnen till cellerna. En fördel med dessa anordningar är att vävnadsfunktion kan karakteriseras och observeras under kontrollerade förhållanden (t.ex. effekten av skjuvspänning på celler, effekten av cyklisk belastning eller andra krafter) för att bättre förstå organets övergripande funktion. Även om dessa 3D-modeller erbjuder bättre modellorganfunktion på cellnivå jämfört med 2D-modeller, finns det fortfarande utmaningar. Några av utmaningarna inkluderar: avbildning av cellerna, kontroll av gradienter i statiska modeller (dvs utan ett perfusionssystem) och svårigheter att återskapa kärlsystem . Trots dessa utmaningar används 3D-modeller fortfarande som verktyg för att studera och testa läkemedelssvar i farmakologiska studier. På senare år finns det mikrofluidiska enheter som reproducerar det komplexa mikrovaskulära nätverket in vivo . Organ-on-a-chip har också använts för att replikera mycket komplexa system som lungepitelceller i en exponerad luftväg och ger värdefull insikt om hur flercelliga system och vävnader fungerar in vivo. Dessa enheter kan skapa en fysiologiskt realistisk 3D-miljö, vilket är önskvärt som ett verktyg för läkemedelsscreening, läkemedelsleverans, cell-cell-interaktioner, tumörmetastaser etc. I en studie odlade forskare tumörceller och testade läkemedelstillförseln av cis-platin , resveratrol, tirapazamin (TPZ) och mätte sedan effekterna som läkemedlen har på cellviabiliteten.

Tillämpningar av celler i mikrofluidiska system

Mikrofluidiska system kan användas för att odla flera celltyper.

Odling av däggdjursceller

Däggdjurscellkulturer kan sås, odlas i flera veckor, lossna och överföras till ett färskt odlingsmedium till illamående med digitala mikrofluidiska (DMF)-anordningar i makroskala.

Odling av icke-däggdjursceller

Alger

Alger kan inkuberas och deras tillväxthastighet och lipidproduktion kan övervakas i ett mikrofluidsystem med hängande droppar. Till exempel, Mishra et al. utvecklat en 25x75 mm, lättillgänglig mikrofluidisk enhet. Denna design används för att optimera förhållandena genom att ändra brunnsdiametrar, UV- ljusexponering (som orsakar mutagenes) och ljus/inget ljus-tester för att odla Botryococcus braunii , som är en av de vanligaste sötvattensmikroalgerna för biobränsleproduktion .

Bakterier och jäst

Mikrofluidsystem kan användas för att inkubera stora volymer av bakterier och jästkolonier . Den tvåskiktiga mikrokemostatenheten är gjord för att tillåta forskare att odla celler under kemostatiska och termostatiska förhållanden utan att flytta runt celler och orsaka intercellulär interaktion. Jästcellsuspensionsdroppar kan placeras på en platta med mönstrade hydrofila områden och inkuberas i 24 timmar; sedan delas dropparna de producerade proteinerna från jäst analyseras med MALDI-MS utan att döda cellerna i de ursprungliga dropparna.

Multikultur inom mikrofluidik

Jämfört med den mycket komplexa mikromiljön in vivo ger traditionell monokultur av enstaka celltyper in vitro endast begränsad information om cellulärt beteende på grund av bristen på interaktioner med andra celltyper. Typiskt kan cell-till-cell-signalering delas in i fyra kategorier beroende på avståndet: endokrin signalering , parakrin signalering , autokrin signalering och juxtakrin signalering . Till exempel, vid parakrin signalering, diffunderar tillväxtfaktorer som utsöndras från en cell över ett kort avstånd till den intilliggande målcellen, medan vid juxtakrin signalering binder membranbundna ligander från en cell direkt till ytreceptorer hos intilliggande celler. Det finns tre konventionella tillvägagångssätt för att införliva cellsignalering i in vitro- cellodling: konditionerad mediaöverföring, blandad (eller direkt) samodling och segregerad (eller indirekt) samodling. Användningen av konditionerade medier, där det odlade mediet av en celltyp (effektorn) introduceras till odlingen av en annan celltyp (responderen), är ett traditionellt sätt att inkludera effekterna av lösliga faktorer i cellsignalering. Denna metod tillåter dock endast envägssignalering, gäller inte kortlivade faktorer (som ofta bryts ned innan överföringen till respondercellkulturen) och tillåter inte tidsmässiga observationer av de utsöndrade faktorerna. Nyligen har samkultur blivit den dominerande metoden för att studera effekten av cellulär kommunikation genom att odla två biologiskt relaterade celltyper tillsammans. Blandad samodling är den enklaste samodlingsmetoden, där två typer av celler är i direkt kontakt inom ett enda odlingsfack vid önskat cellförhållande. Celler kan kommunicera genom parakrin och juxtakrin signalering, men separerade behandlingar och nedströmsanalys av en enskild celltyp är inte lätt genomförbara på grund av den helt blandade populationen av celler. Den vanligaste metoden är segregerad samkultur, där de två celltyperna är fysiskt åtskilda men kan kommunicera i delade medier genom parakrin signalering. Den fysiska barriären kan vara ett poröst membran, en solid vägg eller en hydrogelavdelare . Om den fysiska barriären är borttagbar (som i PDMS eller hydrogel), kan analysen också användas för att studera cellinvasion eller cellmigrering. Samkulturdesigner kan anpassas till tri- eller multikultur, som ofta är mer representativa för in vivo- förhållanden i förhållande till samkultur.

Flerkultursystem med slutna kanaler

Flexibiliteten hos mikrofluidiska enheter bidrar i hög grad till utvecklingen av multikulturstudier genom förbättrad kontroll över rumsliga mönster. Slutna kanalsystem tillverkade av PDMS används oftast eftersom PDMS traditionellt har möjliggjort snabb prototypframställning. Till exempel kan blandad samkultur uppnås i droppbaserad mikrofluidik enkelt genom ett saminkapslingssystem för att studera parakrin och juxtakrin signalering . Två typer av celler är saminkapslade i droppar genom att kombinera två strömmar av cellladdade agaroslösningar. Efter gelning kommer agarosmikrogelerna att fungera som en 3D-mikromiljö för cellsamodling. Segregerad samkultur realiseras också i mikrofluidkanaler för att studera parakrin signalering. Humana alveolära epitelceller och mikrovaskulära endotelceller kan samodlas i kompartmenterade PDMS-kanaler, åtskilda av ett tunt, poröst och töjbart PDMS-membran för att efterlikna alveolär-kapillärbarriären . Endotelceller kan också samodlas med cancerceller i ett monolager medan de separeras av en 3D- kollagenställning för att studera endotelcellsmigration och kapillärtillväxt. När de är inbäddade i geler, kan spottkörteladenoid cystisk karcinom (ACC)-celler samodlas med karcinomassocierad fibroblast (CAF) i en extracellulär 3D-matris för att studera stromareglerad cancerinvasion i 3D-miljön. Om juxtakrin signalering ska undersökas enbart utan parakrin signalering, kan en encellskopplingssamkultur mikrofluidisk array utformas baserat på en cellulär ventilprincip.

Öppen kanal multikultursystem

Även om mikrofluidik med slutna kanaler (diskuteras i avsnittet ovan ) erbjuder hög anpassningsbarhet och biologisk komplexitet för multikultur, kräver operationen ofta hanteringsexpertis och specialiserad utrustning, såsom pumpar och ventiler . Dessutom är användningen av PDMS känd för att orsaka negativa effekter på cellodling, inklusive urlakning av oligomerer eller absorption av små molekyler, vilket ofta betvivlas av biologer. Därför öppna mikrofluidiska enheter gjorda av polystyren (PS), ett väletablerat cellodlingsmaterial, dyka upp. Fördelarna med öppna multikulturdesigner är direkt pipetttillgänglighet och enkel tillverkning ( mikrofräsning , 3D-utskrift , formsprutning eller rakknivsutskrift – utan behov av ett efterföljande bindningssteg eller kanalrensningstekniker). De kan också införlivas i traditionella odlingsartiklar (brunntallrik eller petriskål ) samtidigt som de förblir komplexiteten för multikulturexperiment. Till exempel kan 'monorail-anordningen' som mönstrar hydrogelväggar längs en skena via spontant kapillärflöde sättas in i kommersiellt tillgängliga 24-brunnars plattor. Flexibla mönstergeometrier uppnås genom att bara byta 3D-utskrivna eller frästa skär. Monorail-enheten kan också anpassas för att studera signalering av löslig faktor i flera rike, vilket är svårt i traditionell delad media-samkultur på grund av de olika medierna och odlingskraven för mikrobiella och däggdjursceller. En annan öppen multikulturenhet tillverkad med rakknivsutskrift kan integrera många odlingsmodaliteter, inklusive 2D, 3D, Transwell och sfäroidkultur. Det visar också förbättrad diffusion för att främja löslig faktor parakrin signalering.

Kontroll av cellmikromiljö

Mikrofluidsystem utökar sin förmåga att kontrollera den lokala cellmikromiljön utöver vad som är möjligt med konventionella odlingssystem . Att kunna tillhandahålla olika miljöer på ett stadigt, hållbart och exakt sätt har en betydande inverkan på cellkulturforskning och studier. Dessa miljöfaktorer inkluderar fysikaliska ( skjuvspänning ), biokemiska ( cell-cell-interaktioner , cell-molekyl-interaktioner, cell-substrat-interaktioner) och fysikalisk-kemiska (pH, CO 2 , temperatur , O 2 ) faktorer.

Syrekoncentrationskontroll

Syre spelar en viktig roll i biologiska system. Syrekoncentrationskontroll är ett av nyckelelementen vid utformningen av de mikrofluidiska systemen, oavsett om de är aeroba arter eller vid modulering av cellulära funktioner in vivo , såsom baslinjemetabolism och funktion. Flera mikrofluidsystem har designats för att kontrollera de önskade gaskoncentrationerna för cellodling. av PDMS i ett tunt lager i kanaler (tjocklekar mindre än 50 μm, diffusionskoefficient för syre i naturligt PDMS vid 25 °C, D= 3,55x10 −5 cm 2 s −1 ) utan användning av gasflaskor eller syreavskiljande medel; sålunda kan den mikrofluidiska cellodlingsanordningen placeras i inkubatorer och användas lätt. Emellertid kan PDMS vara problematiskt för adsorptionen av små hydrofoba arter. Poly(metylpenten) (PMP) kan vara ett alternativt material, eftersom det har hög syrepermeabilitet och biokompatibilitet som PDMS. Förutom utmaningarna med att kontrollera gaskoncentrationen är övervakning av syre i mikrofluidsystemet en annan utmaning att ta itu med. Det finns många olika färgämnesindikatorer som kan användas som optisk, luminescensbaserad syreavkänning, som är baserad på fenomenet luminescenssläckning av syre, utan att förbruka syre i systemet. Denna teknik gör övervakning av syre i mikroskaliga miljöer möjlig och kan tillämpas i biologiska laboratorier.

Temperaturkontroll

Temperaturen kan kännas av celler och påverkar deras beteende, såsom biokemisk reaktionskinetik . Det är dock svårt att kontrollera högupplöst temperatur i traditionella cellodlingssystem; medan mikrofluidsystem har visat sig framgångsrikt nå den önskade temperaturen under olika temperaturförhållanden genom flera tekniker. Till exempel kan temperaturgradienten i mikrofluidsystemet uppnås genom att blanda två eller flera ingångar vid olika temperaturer och flödeshastigheter, och temperaturen mäts i utloppskanalerna genom att bädda in polymerbaserade akvariumtermoelement . Genom att installera värmare och digitala temperatursensorer vid basen av det mikrofluidiska systemet har det också visats att ett mikrofluidiskt cellodlingssystem kan arbeta kontinuerligt i minst 500 timmar. De cirkulerande vattenkanalerna i mikrofluidsystemet används också för att exakt kontrollera temperaturen i cellodlingskanalerna och kamrarna. Att placera enheten i en cellkulturinkubator kan dessutom enkelt kontrollera cellodlingstemperaturen.

Se även

Referenser

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Microfluidic_cell_culture&oldid=1135917132 "