Kooperativ bindning

Kooperativ bindning sker i molekylära bindningssystem som innehåller mer än en typ eller art av molekyler och där en av partnerna inte är monovalent och kan binda mer än en molekyl av den andra arten. I allmänhet är molekylär bindning en interaktion mellan molekyler som resulterar i en stabil fysisk association mellan dessa molekyler.

Kooperativ bindning sker i ett molekylärt bindningssystem där två eller flera ligandmolekyler kan binda till en receptormolekyl . Bindning kan betraktas som "samverkande" om den faktiska bindningen av den första molekylen i liganden till receptorn ändrar bindningsaffiniteten för den andra ligandmolekylen. Bindningen av ligandmolekyler till de olika platserna på receptormolekylen utgör inte ömsesidigt oberoende händelser. Kooperativitet kan vara positiv eller negativ, vilket innebär att det blir mer eller mindre troligt att successiva ligandmolekyler binder till receptormolekylen.

Kooperativ bindning observeras i många biopolymerer, inklusive proteiner och nukleinsyror . Kooperativ bindning har visat sig vara mekanismen bakom ett stort antal biokemiska och fysiologiska processer.

Historia och matematiska formalismer

Christian Bohr och begreppet kooperativ bindning

År 1904 studerade Christian Bohr hemoglobinbindning till syre under olika förhållanden. När han ritade hemoglobinmättnad med syre som en funktion av syrepartialtrycket , fick han en sigmoidal (eller "S-formad") kurva. Detta indikerar att ju mer syre som är bundet till hemoglobin, desto lättare är det för mer syre att binda - tills alla bindningsställen är mättade. Dessutom märkte Bohr att ökande CO ₂ -tryck flyttade denna kurva åt höger - dvs högre koncentrationer av CO ₂ gör det svårare för hemoglobin att binda syre. Detta senare fenomen, tillsammans med observationen att hemoglobinets affinitet för syre ökar med ökande pH, är känt som Bohr-effekten .

Originalfigur från Christian Bohr , som visar den sigmoida ökningen av oxyhemoglobin som en funktion av partialtrycket av syre.

En receptormolekyl sägs uppvisa kooperativ bindning om dess bindning till ligand skalar icke-linjärt med ligandkoncentration. Kooperativiteten kan vara positiv (om bindning av en ligandmolekyl ökar receptorns skenbara affinitet och därmed ökar chansen för en annan ligandmolekylbindning) eller negativ (om bindning av en ligandmolekyl minskar affiniteten och därmed gör bindning av andra ligandmolekyler mindre sannolikt) . Den "fraktionerade beläggningen" ${\bar {Y}}$ för en receptor med en given ligand definieras som mängden ligandbundna bindningsställen dividerat med den totala kvantiteten ligandbindningsställen:

${\bar {Y}}={\frac {[{\text{bundna webbplatser}}] }{[{\text{bundna webbplatser}}]+[{\text{obundna webbplatser}}]}}={\frac {[{\text{bundna webbplatser}}]}{[{\text{totalt webbplatser} }]}}$

Om ${\bar {Y}}=0$ är proteinet helt obundet, och om ${\bar {Y}}=1$ är det helt mättat. Om plotten av ${\bar {Y}}$ vid jämvikt som en funktion av ligandkoncentrationen är sigmoidal till formen, som observerats av Bohr för hemoglobin, indikerar detta positiv kooperativitet. Om det inte är det, kan inget uttalande göras om samarbetsförmåga bara genom att titta på denna tomt.

Konceptet med kooperativ bindning gäller endast molekyler eller komplex med mer än en ligandbindningsställe. Om flera ligandbindningsställen existerar, men ligandbindning till något ställe inte påverkar de andra, sägs receptorn vara icke-samverkande. Kooperativitet kan vara homotropisk , om en ligand påverkar bindningen av ligander av samma slag, eller heterotropisk , om den påverkar bindningen av andra typer av ligander. När det gäller hemoglobin observerade Bohr homotropisk positiv kooperativitet (bindning av syre underlättar bindning av mer syre) och heterotrop negativ kooperativitet (bindning av CO ₂ minskar hemoglobinets förmåga att binda syre.)

Under hela 1900-talet har olika ramverk utvecklats för att beskriva bindningen av en ligand till ett protein med mer än ett bindningsställe och de kooperativa effekter som observerats i detta sammanhang.

Hillekvationen

Den första beskrivningen av kooperativ bindning till ett multi-site protein utvecklades av AV Hill . Utgående från observationer av syrebindning till hemoglobin och tanken att kooperativitet uppstod från aggregeringen av hemoglobinmolekyler, var och en binder en syremolekyl, föreslog Hill en fenomenologisk ekvation som sedan dess har fått sitt namn efter honom :

Hill-plot av Hill-ekvationen i rött, som visar kurvans lutning som Hill-koefficienten och skärningen med x-axeln som ger den skenbara dissociationskonstanten. Den gröna linjen visar den icke-samverkande kurvan.

${\bar {Y }}={\frac {K\cdot {}[X]^{n}}{1+K\cdot {}[X]^{n}}}={\frac {[X]^{n}} {K^{*}+[X]^{n}}}={\frac {[X]^{n}}{K_{d}^{n}+[X]^{n}}}$

där $n$ är "Hill-koefficienten", $[X]$ betecknar ligandkoncentration, $K$ betecknar en skenbar associationskonstant (används i den ursprungliga formen av ekvationen), $K^{*}$ är en empirisk dissociationskonstant och $K_{d}$ en mikroskopisk dissociationskonstant (används i moderna former av ekvationen och motsvarar en ${\ displaystyle \mathrm {EC} _{50}}$ ). Om $n<1$ uppvisar systemet negativ kooperativitet, medan kooperativitet är positiv om $n>1$ . Det totala antalet ligandbindningsställen är en övre gräns för $n$ . Hill-ekvationen kan linjäriseras som:

$\log {\frac {\bar {Y}}{1-{\bar {Y}}}} =n\cdot {}\log[X]-n\cdot {}\log K_{d}$

"Kullplotten" erhålls genom att plotta $\log {\frac {\bar {Y}}{1-{\bar {Y}}}}$ kontra $\log[X]$ . I fallet med Hill-ekvationen är det en linje med lutning $n_{H}$ och intercept $\log(K_{d})$ . Detta innebär att kooperativiteten antas vara fixerad, dvs den förändras inte med mättnad. Det betyder också att bindningsställen alltid uppvisar samma affinitet, och kooperativitet uppstår inte från en affinitet som ökar med ligandkoncentrationen.

Adairs ekvation

GS Adair fann att Hill-diagrammet för hemoglobin inte var en rak linje, och antog att bindningsaffinitet inte var en fast term, utan beroende av ligandmättnad. Efter att ha visat att hemoglobin innehöll fyra hemer (och därför bindningsställen för syre), arbetade han från antagandet att fullt mättat hemoglobin bildas i steg, med mellanformer med en, två eller tre bundna syremolekyler. Bildandet av varje mellanstadium från obundet hemoglobin kan beskrivas med användning av en skenbar makroskopisk associationskonstant $K_{i$ . Den resulterande fraktionerade beläggningen kan uttryckas som:

${\bar {Y}}={\frac {1}{4}}\cdot {}{\frac { K_{I}[X]+2K_{II}[X]^{2}+3K_{III}[X]^{3}+4K_{IV}[X]^{4}}{1+K_{I [X]+K_{II}[X]^{2}+K_{III}[X]^{3}+K_{IV}[X]^{4}}}$

Eller, för vilket protein som helst med n ligandbindningsställen:

${\bar {Y}}={\frac {1}{n}}{\frac {K_{I}[X]+2K_{II}[X]^{2}+\ldots +nK_{n}[X]^{n}}{1+K_{I}[X]+K_{II}[X]^{2}+\ldots +K_{n}[X]^{n} }}$

där n anger antalet bindningsställen och varje $K_{i}$ är en kombinerad associationskonstant, som beskriver bindningen av i- ligandmolekyler Genom att kombinera Adair-behandlingen med Hill-intrigen kommer man fram till den moderna experimentella definitionen av kooperativitet (Hill, 1985, Abeliovich, 2005). Den resulterande Hill-koefficienten, eller mer korrekt lutningen av Hill-plotten beräknad från Adair-ekvationen, kan visas vara förhållandet mellan variansen för bindningstalet och variansen för bindningstalet i ett ekvivalent system av icke-interagerande bindningsställen. Således definierar Hill-koefficienten kooperativitet som ett statistiskt beroende av ett bindningsställe på tillståndet för andra ställen.

Klotz-ekvationen

Irving Klotz arbetade med kalciumbindande proteiner och dekonvolerade Adairs associationskonstanter genom att överväga stegvis bildande av mellanstadierna, och försökte uttrycka den kooperativa bindningen i termer av elementära processer som styrs av massaktionslagstiftningen. I hans ramverk $K_{1}$ associationskonstanten som styr bindningen av den första ligandmolekylen, $K_{2}$ associationskonstanten som styr bindningen av den andra ligandmolekylen (en gång den första är redan bunden) etc. För ${\bar {Y}}$ ger detta:

${\bar {Y}}={\frac {1}{n}}{\frac {K_{1}[X ]+2K_{1}K_{2}[X]^{2}+\ldots +n\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right)[X]^{n}} {1+K_{1}[X]+K_{1}K_{2}[X]^{2}+\ldots +\left(K_{1}K_{2}\ldots K_{n}\right) [X]^{n}}}$

Det är värt att notera att konstanterna ${\displaystyle K_{1}} ,$ K $\displaystyle K_{2}}$ och så vidare inte hänför sig till enskilda bindningsplatser. De beskriver hur många bindningsställen som är upptagna, snarare än vilka . Denna form har fördelen att kooperativitet lätt känns igen när man betraktar associationskonstanter. Om alla ligandbindningsställen är identiska med en mikroskopisk associationskonstant $K$ , skulle man förvänta sig ${\displaystyle K_{1 }=nK,K_{2}={\frac {n-1}{2}}K,\ldots K_{n}={\frac {1}{n}}K} (det vill$ säga ${\displaystyle K_{i}={\frac {n-i+1}{i}}K} )$ i frånvaro av samarbetsförmåga. Vi har positiv kooperativitet om $K_{i}$ ligger över dessa förväntade värden för $i>1$ .

Klotz-ekvationen (som ibland också kallas Adair-Klotz-ekvationen) används fortfarande ofta i den experimentella litteraturen för att beskriva mätningar av ligandbindning i termer av sekventiella skenbara bindningskonstanter.

Paulings ekvation

Vid mitten av 1900-talet fanns ett ökat intresse för modeller som inte bara skulle beskriva bindningskurvor fenomenologiskt, utan erbjuda en underliggande biokemisk mekanism. Linus Pauling omtolkade ekvationen från Adair, och antog att hans konstanter var kombinationen av bindningskonstanten för liganden ( $K$ i ekvationen nedan) och energi som kommer från interaktionen mellan subenheter av det kooperativa proteinet ( ${ \displaystyle \alpha }$ nedan). Pauling härledde faktiskt flera ekvationer, beroende på graden av interaktion mellan underenheter. Baserat på felaktiga antaganden om lokaliseringen av hemes, valde han fel för att beskriva syrebindning av hemoglobin, förutsatt att subenheten var arrangerad i en kvadrat. Ekvationen nedan ger ekvationen för en tetraedrisk struktur, vilket skulle vara mer exakt i fallet med hemoglobin:

${\bar {Y}}={\frac {K[X]+3\alpha {}K^{2} [X]^{2}+3\alfa {}^{3}K^{3}[X]^{3}+\alfa {}^{6}K^{4}[X]^{4} }{1+4K[X]+6\alfa {}K^{2}[X]^{2}+4\alfa {}^{3}K^{3}[X]^{3}+\ alfa {}^{6}K^{4}[X]^{4}}}$

KNF-modellen

Baserat på resultat som visar att strukturen hos kooperativa proteiner förändrades vid bindning till deras ligand, förfinade Daniel Koshland och kollegor den biokemiska förklaringen av mekanismen som beskrevs av Pauling. Koshland-Némethy-Filmer (KNF)-modellen antar att varje subenhet kan existera i en av två konformationer: aktiv eller inaktiv. Ligandbindning till en subenhet skulle inducera en omedelbar konformationsförändring av den subenheten från den inaktiva till den aktiva konformationen, en mekanism som beskrivs som "inducerad passning". Kooperativitet, enligt KNF-modellen, skulle uppstå från interaktioner mellan subenheterna, vars styrka varierar beroende på den relativa konformationen av de involverade subenheterna. För en tetraedrisk struktur (de ansåg också linjära och kvadratiska strukturer) föreslog de följande formel:

${\bar {Y}} ={\frac {K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t}[X])+3K_{AB}^{4}K_{BB}(K_{X}K_{t}[X] ])^{2}+3K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t}[X])^{3}+K_{BB}^{6}( K_{X}K_{t}[X])^{4}}{1+4K_{AB}^{3}(K_{X}K_{t}[X])+6K_{AB}^{4} K_{BB}(K_{X}K_{t}[X])^{2}+4K_{AB}^{3}K_{BB}^{3}(K_{X}K_{t}[X] )^{3}+K_{BB}^{6}(K_{X}K_{t}[X])^{4}}}$

Där $K_{X}$ är associationskonstanten för X, $K_{t}$ är förhållandet mellan B- och A-tillstånd i frånvaro av ligand ("övergång"), $K_{AB}$ och $K_{BB}$ är de relativa stabiliteterna för par av angränsande underenheter i förhållande till ett par där båda underenheterna är i A-tillståndet (Observera att KNF-papperet faktiskt presenterar $N_{s}$ , antalet ockuperade webbplatser, som här är 4 gånger ${\displaystyle {\bar {Y}}} )$ .

MWC-modellen

Monod-Wyman-Changeux modellreaktionsschema för ett protein som består av två protomerer. Protomeren kan existera under två tillstånd, var och en med olika affinitet för liganden. L är förhållandet mellan tillstånd i frånvaro av ligand, c är förhållandet mellan affiniteter.

Energidiagram av en Monod-Wyman-Changeux-modell av ett protein som består av två protomerer. Den större affiniteten hos liganden för R-tillståndet betyder att det senare företrädesvis stabiliseras av bindningen.

Monod -Wyman-Changeux (MWC) -modellen för samordnade allosteriska övergångar gick ett steg längre genom att utforska kooperativitet baserad på termodynamik och tredimensionella konformationer. Det formulerades ursprungligen för oligomera proteiner med symmetriskt arrangerade, identiska subenheter, som var och en har ett ligandbindningsställe. Enligt detta ramverk samexisterar två (eller flera) interkonvertibla konformationstillstånd av ett allosteriskt protein i en termisk jämvikt. Tillstånden - ofta kallade spänd (T) och avslappnad (R) - skiljer sig i affinitet för ligandmolekylen. Förhållandet mellan de två tillstånden regleras av bindningen av ligandmolekyler som stabiliserar tillståndet med högre affinitet. Viktigt är att alla underenheter av en molekyl förändras tillstånd samtidigt, ett fenomen som kallas "koncentrerad övergång".

Den allosteriska isomeriseringskonstanten L beskriver jämvikten mellan båda tillstånden när ingen ligandmolekyl är bunden: $L={\frac {\left[T_{0}\right]}{\left[ R_{0}\right]}}$ . Om L är mycket stort, existerar det mesta av proteinet i T-tillståndet i frånvaro av ligand. Om L är litet (nära ett) är R-tillståndet nästan lika befolkat som T-tillståndet. Förhållandet mellan dissociationskonstanter för liganden från T- och R-tillstånden beskrivs av konstanten c : $c={\frac {K_{d}^{R}}{K_{ d}^{T}}}$ . Om $c=1$ har både R- och T-tillstånden samma affinitet för liganden och liganden påverkar inte isomeriseringen. Värdet på c indikerar också hur mycket jämvikten mellan T- och R-tillstånden förändras vid ligandbindning: ju mindre c , desto mer skiftar jämvikten mot R-tillståndet efter en bindning. Med $\alpha ={\frac {[X]}{K_{d}^{R}}}$ beskrivs delbeläggning som:

${\bar {Y}} ={\frac {\alpha (1+\alpha )^{n-1}+Lc\alpha (1+c\alpha )^{n-1}}{(1+\alpha )^{n}+L (1+c\alpha )^{n}}}$

Sigmoid Hill-plotten av allosteriska proteiner kan sedan analyseras som en progressiv övergång från T-tillståndet (låg affinitet) till R-tillståndet (hög affinitet) när mättnaden ökar. Lutningen på Hill-plotten beror också på mättnad, med ett maximalt värde vid böjningspunkten. Skärmen mellan de två asymptoterna och y-axeln gör det möjligt att bestämma affiniteterna för båda tillstånden för liganden.

Hill plot av MWC-bindningsfunktionen i rött, av de rena T- och R-tillstånden i grönt. När konformationen skiftar från T till R, gör även bindningsfunktionen. Skärningarna med x-axeln ger den skenbara dissociationskonstanten såväl som de mikroskopiska dissociationskonstanterna för R- och T-tillstånd.

I proteiner är konformationsförändring ofta förknippad med aktivitet eller aktivitet mot specifika mål. Sådan aktivitet är ofta det som är fysiologiskt relevant eller det som mäts experimentellt. Graden av konformationsförändring beskrivs av tillståndsfunktionen ${\displaystyle {\bar {R}}},$ som anger fraktionen av protein som finns i $R$ -tillståndet. Som energidiagrammet visar ${\bar {R}}$ när fler ligandmolekyler binder. Uttrycket för ${\bar {R}}$ är:

${\bar {R}}={\frac {(1+\alpha )^{n}} {(1+\alpha )^{n}+L(1+c\alpha )^{n}}}$

En avgörande aspekt av MWC-modellen är att kurvorna för ${\bar {Y}}$ och ${\bar {R}}$ inte sammanfaller, dvs. bråkmättnad är inte en direkt indikator på konformationstillstånd (och därmed på aktivitet). Omfattningen av bindningens kooperativitet och aktiveringens kooperativitet kan dessutom vara mycket olika: ett extremfall tillhandahålls av bakteriens flagellamotor med en Hill-koefficient på 1,7 för bindningen och 10,3 för aktiveringen. Svarets supralinjäritet kallas ibland ultrasensitivitet .

Om ett allosteriskt protein binder till ett mål som också har en högre affinitet för R-tillståndet, stabiliserar målbindning R-tillståndet ytterligare, vilket ökar ligandaffiniteten. Om å andra sidan ett mål företrädesvis binder till T-tillståndet kommer målbindning att ha en negativ effekt på ligandaffiniteten. Sådana mål kallas allosteriska modulatorer .

Sedan starten har MWC-ramverket utökats och generaliserats. Variationer har föreslagits, till exempel för att tillgodose proteiner med mer än två tillstånd, proteiner som binder till flera typer av ligander eller flera typer av allosteriska modulatorer och proteiner med icke-identiska subenheter eller ligandbindningsställen.

Exempel

Listan över molekylära sammansättningar som uppvisar kooperativ bindning av ligander är mycket stor, men några exempel är särskilt anmärkningsvärda för deras historiska intresse, deras ovanliga egenskaper eller deras fysiologiska betydelse.

Tecknad representation av proteinet hemoglobin i dess två konformationer: "spänd (T)" till vänster som motsvarar deoxiformen (härledd från PDB id:11LFL) och "avslappnad (R)" till höger motsvarande oxiformen (härledd från PDB id:1LFT).

Som beskrivs i det historiska avsnittet är det mest kända exemplet på kooperativ bindning hemoglobin . Dess kvartära struktur, löst av Max Perutz med hjälp av röntgendiffraktion, uppvisar en pseudosymmetrisk tetraeder som bär fyra bindningsställen (hem) för syre. Många andra molekylära sammansättningar som uppvisar kooperativ bindning har studerats i stor detalj.

Multimera enzymer

Aktiviteten hos många enzymer regleras av allosteriska effektorer . Vissa av dessa enzymer är multimera och har flera bindningsställen för regulatorerna.

Treonindeaminas var ett av de första enzymerna som föreslogs bete sig som hemoglobin och visade sig binda ligander i samarbete. Det visade sig senare vara ett tetrameriskt protein.

Ett annat enzym som tidigt har föreslagits för att binda ligander i samarbete är aspartat trans-karbamylas . Även om initiala modeller överensstämde med fyra bindningsställen, visades dess struktur senare vara hexamerisk av William Lipscomb och kollegor.

Jonkanaler

De flesta jonkanaler är bildade av flera identiska eller pseudoidentiska monomerer eller domäner, arrangerade symmetriskt i biologiska membran. Flera klasser av sådana kanaler vars öppning regleras av ligander uppvisar kooperativ bindning av dessa ligander.

Det föreslogs så tidigt som 1967 (när den exakta karaktären av dessa kanaler fortfarande var okänd) att nikotinacetylkolinreceptorerna band acetylkolin på ett samarbetssätt på grund av förekomsten av flera bindningsställen. Reningen av receptorn och dess karakterisering visade en pentamerisk struktur med bindningsställen belägna vid gränsytan mellan subenheter, bekräftad av strukturen hos den receptorbindande domänen.

Inositoltrifosfat (IP3)-receptorer bildar en annan klass av ligandstyrda jonkanaler som uppvisar kooperativ bindning. Strukturen av dessa receptorer visar fyra IP3-bindningsställen symmetriskt arrangerade.

Multi-site molekyler

Även om de flesta proteiner som visar samverkande bindning är multimera komplex av homologa subenheter, bär vissa proteiner flera bindningsställen för samma ligand på samma polypeptid. Ett sådant exempel är calmodulin . En molekyl av kalmodulin binder fyra kalciumjoner tillsammans. Dess struktur presenterar fyra EF-handdomäner , var och en binder en kalciumjon. Molekylen uppvisar inte en kvadratisk eller tetraederstruktur, utan är bildad av två lober som var och en bär två EF-handdomäner.

Tecknad representation av proteinet Calmodulin i dess två konformationer: "stängt" till vänster (härlett från PDB -id: 1CFD) och "öppet" till höger (härlett från PDB -id: 3CLN). Den öppna konformationen representeras bunden med 4 kalciumjoner (orange sfärer).

Transkriptionsfaktorer

Kooperativ bindning av proteiner till nukleinsyror har också visats. Ett klassiskt exempel är bindningen av lambdafagrepressorn till dess operatörer, vilket sker i samarbete. Andra exempel på transkriptionsfaktorer uppvisar positiv kooperativitet när de binder deras mål, såsom repressorn för TtgABC-pumparna (n=1,6), såväl som villkorlig kooperativitet som uppvisas av transkriptionsfaktorerna HOXA11 och FOXO1 .

Omvänt dokumenterades också exempel på negativ kooperativitet för bindning av transkriptionsfaktorer, som för den homodimera repressorn av Pseudomonas putida cytokrom P450cam hydroxylasoperon (n=0,56).

Konformationell spridning och bindande kooperativitet

Tidigt har det hävdats att vissa proteiner, särskilt de som består av många subenheter, skulle kunna regleras av en generaliserad MWC-mekanism, där övergången mellan R- och T-tillstånd inte nödvändigtvis synkroniseras över hela proteinet. 1969 föreslog Wyman en sådan modell med "blandade konformationer" (dvs vissa protomerer i R-tillståndet, några i T-tillståndet) för respiratoriska proteiner hos ryggradslösa djur.

Efter en liknande idé, subsumerar den konformationella spridningsmodellen av Duke och kollegor både KNF- och MWC-modellen som specialfall. I denna modell ändrar inte en subenhet automatiskt konformation vid ligandbindning (som i KNF-modellen), inte heller ändrar alla subenheter i ett komplex konformation tillsammans (som i MWC-modellen). Konformationsförändringar är stokastiska med sannolikheten för att en subenhet byter tillstånd beroende på om den är ligandbunden eller inte och på det konformationella tillståndet för angränsande subenheter. Således kan konformationstillstånd "sprida sig" runt hela komplexet.

Inverkan av uppströms och nedströms komponenter på modulens ultrakänslighet

I en levande cell är ultrakänsliga moduler inbäddade i ett större nätverk med uppströms och nedströms komponenter. Dessa komponenter kan begränsa intervallet av ingångar som modulen kommer att ta emot såväl som intervallet av modulens utgångar som nätverket kommer att kunna upptäcka. Känsligheten hos ett modulärt system påverkas av dessa restriktioner. De dynamiska omfångsbegränsningarna som åläggs av nedströmskomponenter kan ge effektiva känsligheter som är mycket större än originalmodulens när den betraktas isolerad.