Klinisk metagenomisk sekvensering

Klinisk metagenomisk nästa generations sekvensering ( mNGS ) är den omfattande analysen av mikrobiellt och värdgenetiskt material ( DNA eller RNA ) i kliniska prover från patienter genom nästa generations sekvensering . Den använder metagenomics tekniker för att identifiera och karakterisera genomet av bakterier , svampar , parasiter och virus utan att behöva ha förkunskaper om en specifik patogen direkt från kliniska prover. Förmågan att detektera alla potentiella patogener i ett prov gör metagenomisk nästa generations sekvensering till ett kraftfullt verktyg vid diagnos av infektionssjukdomar, särskilt när andra mer riktade analyser, såsom PCR , misslyckas. Dess begränsningar inkluderar klinisk användbarhet, laboratorievaliditet, känsla och känslighet, kostnads- och regulatoriska överväganden.

Utanför klinisk medicin bedrivs liknande arbete för att identifiera genetiskt material i miljöprover , såsom dammar eller jord.

Definition

Nästa generations sekvensering använder teknikerna för metagenomik för att identifiera och karakterisera genomet av bakterier , svampar , parasiter och virus utan behov av förkunskaper om en specifik patogen direkt från kliniska prover. Förmågan att detektera alla potentiella patogener i ett prov gör metagenomisk nästa generations sekvensering till ett kraftfullt verktyg vid diagnos av infektionssjukdomar, särskilt när andra mer riktade analyser, såsom PCR , misslyckas.

Laboratoriearbetsflöde

Ett typiskt mNGS-arbetsflöde består av följande steg:

  • Provtagning: de vanligaste proverna för metagenomisk sekvensering är blod , avföring, cerebrospinalvätska (CSF), urin eller nasofaryngeala pinnprover . Bland dessa är blod och CSF de renaste, med mindre bakgrundsljud, medan de andra förväntas ha en stor mängd kommensaler och/eller opportunistiska infektioner och därmed ha mer bakgrundsljud. Prover bör tas med stor försiktighet eftersom kirurgiska prover kan kontamineras under hantering av biopsi ; till exempel kan lumbalpunktioner för att ta CSF-prover vara kontaminerade under proceduren.
  • RNA/DNA-extraktion: DNA och RNA från provet extraheras med hjälp av en extraktionssats. Om det finns en stark tidigare misstanke om patogengenomets sammansättning och eftersom mängden patogen nukleinsyra i fler brusprover överväldigas av RNA/DNA från andra organismer, skulle valet av ett extraktionskit med endast RNA eller DNA vara en mer specifik och bekvämt tillvägagångssätt. Några säljbara tillgängliga kit är till exempel RNeasy PowerSoil Total RNA kit ( Qiagen ), RNeasy Minikit (Qiagen), MagMAX Viral Isolation kit (ABI), Viral RNA Minikit (Qiagen).
  • Optimeringsstrategier för biblioteksberedning: på grund av höga nivåer av bakgrundsbrus i metagenomisk sekvensering har flera målanrikningsförfaranden utvecklats som syftar till att öka sannolikheten för att fånga patogenhärledda transkript och/eller genom. Generellt finns det två huvudsakliga tillvägagångssätt som kan användas för att öka mängden patogensignal i ett prov: negativt urval och positiv anrikning.
  1. Negativ selektion (bakgrundsutarmning eller subtraktion) riktar sig mot och eliminerar värdens och mikrobiomets genomiska bakgrund, samtidigt som man syftar till att bevara nukleinsyran som härrör från patogenerna av intresse. Nedbrytning av genomisk bakgrund kan utföras genom bredspektrumuppslutning med nukleaser , såsom DNas I för DNA-bakgrund, eller genom att ta bort rikliga RNA-arter (rRNA, mtRNA, globin-mRNA) med användning av sekvensspecifika RNA-utarmningskit. Även CRISPR-Cas9 -baserade tillvägagångssätt kan utföras för att rikta och utarma humant mitokondriellt RNA till exempel. I allmänhet leder emellertid subtraktionsmetoder till en viss grad av förlust av det riktade patogengenomet, eftersom dålig återhämtning kan inträffa under saneringen.
  2. Positiv anrikning används för att öka patogensignalen snarare än att minska bakgrundsbruset. Detta görs vanligtvis genom hybridiseringsbaserad målinfångning av prober, som används för att dra ut nukleinsyra av intresse för nedströms amplifiering och sekvensering. Panvirala sonder har visat sig framgångsrikt identifiera olika typer av patogener i olika kliniska vätske- och andningsprover och har använts för sekvensering och karakterisering av nya virus. Probemetoden inkluderar dock extra hybridiserings- och saneringssteg, som kräver högre provinmatning, ökar risken för att förlora målet och ökar kostnaden och praktisk tid.
  • Sekvensering med hög genomströmning: alla nukleinsyrafragment i biblioteket sekvenseras. Vilken sekvenseringsplattform som ska användas väljs beroende på olika faktorer såsom laboratoriets forskningsmål, personlig erfarenhet och kompetensnivå. Hittills Illumina MiSeq- systemet visat sig vara den mest använda plattformen för forskning om infektionssjukdomar, patogenövervakning och upptäckt av patogener inom forskning och folkhälsa. Instrumentet är tillräckligt kompakt för att passa på en laboratoriebänk, har en snabb körtid jämfört med andra liknande plattformar och har en stark användarsupportgemenskap. Men med ytterligare förbättringar av denna teknik och med ytterligare felreduktion och mjukvarustabilisering MinION vara ett utmärkt tillskott till arsenalen av nuvarande sekvenseringsteknologier för rutinövervakning, särskilt i mindre laboratorier med begränsade resurser. Till exempel användes MinION framgångsrikt i ZiBRA-projektet för realtidsövervakning av zikavirus av myggor och människor i Brasilien och i Guinea för att utföra realtidsövervakning under det pågående ebolautbrottet . I allmänhet används IlluminaMiSeq, iSeq, Ion Torrent PGM, Oxford Nanopore, MinION för begränsade resurser. Medan för betydande resurser är Illumina NextSeq, NovaSeq, PacBio Sequel, Oxford Nanopore och PromethION att föredra. Dessutom, för patogensekvensering är användningen av kontroller av grundläggande betydelse för att säkerställa mNGS-analyskvalitet och stabilitet över tid; PhiX används som sekvenseringskontroll, sedan inkluderar de andra kontrollerna den positiva kontrollen, en ytterligare intern kontroll (t.ex. spiked DNA eller annan känd patogen) och en negativ kontroll (vanligtvis vattenprov).
  • Bioinformatisk analys: Medan själva sekvenseringen har gjorts allmänt tillgänglig och mer användarvänlig, kräver den dataanalys och tolkning som följer fortfarande specialiserad bioinformatisk expertis och lämpliga beräkningsresurser . Rådata från en sekvenseringsplattform rengörs, trimmas och filtreras vanligtvis för att ta bort läsvärden av låg kvalitet och dubbletter. Avlägsnande av värdgenom / transkriptomavläsningar utförs för att minska bakgrundsljud (t.ex. värd- och miljöavläsningar) och öka frekvensen av patogenavläsningar. Detta steg kommer också att minska nedströms analystiden. Ytterligare borttagning av bakgrundsbrus uppnås genom att kartlägga provavläsningarna till avläsningarna från den negativa kontrollen för att säkerställa eliminering av alla kontaminerande avläsningar, såsom de som är associerade med reagenserna eller provtagningslagringsmediet. De återstående läsningarna sätts vanligtvis ihop de novo för att producera långa sträckor av sekvenser som kallas contigs . Taxonomisk identifiering av de resulterande kontigerna utförs genom att matcha dem med genomen och sekvenser i nukleotid- eller proteindatabaser; för detta används oftast olika versioner av BLAST . Avancerad karakterisering av bakteriella organismer kan också utföras, vilket gör det möjligt att erhålla det nödvändiga djupet och bredden av täckning för genetiska karakteriseringsresultat. Genanrop kan utföras på en mängd olika sätt, inklusive RAST eller genom att använda NCBI- tjänster vid tidpunkten för fullständig genominlämning. Resultat från flera anteckningsverktyg kan jämföras för noggrannhet och fullständighet och, om nödvändigt, slås samman med hjälp av BEACON. För karakterisering av antibiotikaresistensgener används vanligtvis Resistance Gene Identifier från Comprehensive Antibiotic Resistance Database ( CARD). För att karakterisera virulensfaktorgener erbjuder ShortBRED analyser med en anpassad databas från Virulensfaktordatabasen.


Tillämpningar inom infektionssjukdomar

Ett sätt att upptäcka dessa patogener är att upptäcka en del av deras genom genom metagenomisk sekvensering ( Next Generation Sequencing -mNGS), som kan vara riktade eller oriktade.

Målinriktad

På grund av det ökar vanligtvis känsligheten för att upptäcka mikroorganismer som riktas mot, men detta kommer med en begränsning av mängden identifierbara patogener.

Oriktat

Den oriktade analysen är en metagenomisk Shotgun-sekvensering . Hela DNA:t och/eller RNA:t sekvenseras med detta tillvägagångssätt med användning av universella primrar . De resulterande mNGS-avläsningarna kan sättas samman till partiella eller fullständiga genom. Dessa genomsekvenser gör det möjligt att övervaka sjukhusutbrott för att underlätta infektionskontroll och folkhälsoövervakning. De kan också användas för subtypning (identifiera en specifik genetisk variant av en mikroorganism).

Untargeted mNGS är den mest lovande metoden för att analysera kliniska prover och ge en omfattande diagnos av infektioner. Olika grupper har validerat mNGS i Clinical Laboratory Improvement Amendments ( CLIA ), såsom meningit eller encefalit, sepsis och lunginflammation. Denna metod kan vara till stor hjälp i de miljöer där ingen exakt infektiös etiologi misstänks. Till exempel, hos patienter med misstänkt lunginflammation, har identifiering av den underliggande infektionsetiologin som i COVID-19 viktiga kliniska och folkhälsoimplikationer.

Den traditionella metoden består i att formulera en differentialdiagnos utifrån patientens anamnes, en klinisk presentation, bildröntgen och laboratorietester. Men här föreslås ett annat sätt att diagnostisera; metagenomisk nästa generations sekvensering (NGS) är en lovande metod eftersom ett omfattande spektrum av potentiella orsaker (virala, bakteriella, svampar och parasitiska) kan identifieras med en enda analys.

Nedan finns några exempel på metagenomisk sekvenseringstillämpning vid diagnos av infektionssjukdomar.

Exempel

Diagnos av meningit och encefalit

Den traditionella metoden som används för att diagnostisera infektionssjukdomar har i vissa fall ifrågasatts: neuroinflammatoriska sjukdomar, brist på diagnostiska tester för sällsynta patogener och den begränsade tillgängligheten och volymen av prover från det centrala nervsystemet (CNS), på grund av kravet på invasiva procedurer . På grund av dessa problem föreslår vissa analyser ett annat sätt att diagnostisera, vilket är den metagenomiska nästa generations sekvensering (NGS). Sammanfattningsvis kan NGS identifiera ett brett spektrum av patogener i ett enda test.

Vissa studier utvärderar den kliniska användbarheten av metagenomisk NGS för diagnos av neurologiska infektioner, parallellt med konventionella mikrobiologiska tester. Man har sett att det högsta diagnostiska utbytet resulterade från en kombination av metagenomisk NGS av CSF och konventionella tester, inklusive serologisk testning och testning av andra provtyper än CSF. Ibland förblir neurologiska infektioner odiagnostiserade hos en del av patienterna trots konventionell testning.

Resultaten av metagenomisk NGS kan också vara värdefulla även när de överensstämmer med resultaten från konventionella tester, och ger inte bara en försäkran om att den konventionellt erhållna diagnosen är korrekt utan även potentiellt upptäcker eller utesluter saminfektioner, speciellt hos patienter med nedsatt immunförsvar.

Studie av antimikrobiell resistens

Numera för att upptäcka resistens hos olika mikrober används en teknik som kallas Antibiotic Sensitivity (AST), men flera studier har upptäckt att bakteriell resistens finns i genomet och det överförs genom horisontell väg (HGT), så sekvenseringsmetoder utvecklas för att underlätta identifiering och karakterisering av dessa genom och metagenom. För närvarande finns följande metoder för att upptäcka antimikrobiell resistens:

  • Antibiotikakänslighet: en fördel med denna metod är att den ger information för patienternas behandling. Det finns också några nackdelar, en av dem är att denna teknik endast är användbar i odlingsbara bakterier för vilka det krävs kompetent personal.
  • Sekvenseringsmetoder: några fördelar med dessa metoder jämfört med AST-tekniken är att den är snabb och förnuftig, den är användbar på både bakterier som växer på artificiella medier och de som inte gör det, och den tillåter jämförelse av studier i flera organismer. En typ av sekvenseringsmetod kan användas framför en annan beroende på typen av prov, för ett genomiskt prov används sammansättningsbaserade metoder ; för ett metagenomiskt prov är det att föredra att använda läsbaserade metoder .

Metagenomiska sekvenseringsmetoder har gett bättre resultat än genomik, på grund av att dessa innehåller mindre antal falska negativa. Inom metagenomisk sekvensering är funktionell metagenomik ett kraftfullt tillvägagångssätt för att karakterisera resistomer ; ett metagenomiskt bibliotek genereras genom kloning av det totala gemenskaps-DNA som extraherats från ett prov till en expressionsvektor , detta bibliotek analyseras med avseende på antimikrobiell resistens genom utstrykning på selektiva medier som är dödliga för vildtypsvärden. De utvalda insättningarna från de överlevande rekombinanta, antimikrobiella resistenta värdcellerna sekvenseras sedan, och resulterande sekvenser sätts sedan ihop och kommenteras (PARFuMS).

Funktionell metagenomik har möjliggjort upptäckten av flera nya antimikrobiella resistensmekanismer och deras relaterade gener, ett sådant exempel är den nyligen upptäckta tetracyklinresistensmekanismen av tetracyklindestruktaser. Det är viktigt att inte bara införliva den antimikrobiella resistensgensekvensen och mekanismen utan också det genomiska sammanhanget, värdbakteriearter och geografisk plats ( metagenom ).

Pandemiberedskap

Potentiellt farliga patogener som ebolavirus , coronavirus etc., och den närmaste genetiska släktingen för okända patogener, kunde identifieras omedelbart, vilket föranledde ytterligare uppföljning. Dess roll i framtiden för pandemiberedskap förväntas och kan existera som det tidigaste övervakningssystem vi kan behöva för att upptäcka utbrott av okänd etiologi och för att svara på ett lämpligt sätt.

Kliniska mikrobiomanalyser

Användningen av mNGS för att karakterisera mikrobiomet har möjliggjort utvecklingen av bakteriell probiotika för att administreras som piller, till exempel som en behandling av Clostridium difficile -associerade sjukdomar.

Mänskliga värdsvarsanalyser

Att studera genuttryck gör det möjligt att karakterisera många infektioner, till exempel infektioner på grund av Staphylococcus aureus , borrelia , candidiasis , tuberkulos och influensa . Detta tillvägagångssätt kan också användas för cancerklassificering . [ citat behövs ]

RNAseq-analys har många andra syften och tillämpningar som att identifiera nya eller underskattade värd-mikrobiella interaktioner direkt från kliniska prover, att ställa indirekt diagnos på grundval av ett patogenspecifikt mänskligt värdsvar och att särskilja infektiösa kontra icke-infektiösa orsaker till akuta orsaker. sjukdom.

Utmaningar

Klinisk nytta

Även om de flesta av de metagenomiska resultatdata som genereras består av fallrapporter som motsäger det ökande intresset för diagnostisk metagenomik.

Följaktligen finns det en övergripande brist på penetration av detta tillvägagångssätt i det kliniska mikrobiologiska laboratoriet, eftersom att ställa en diagnos med metagenomik fortfarande i princip bara är användbar i samband med fallrapport men inte för ett verkligt dagligt diagnostiskt syfte.

Från och med 2018 drog kostnadseffektivitetsmodellering av metagenomik vid diagnos av feber av okänt ursprung slutsatsen att även efter begränsning av kostnaden för diagnostisk metagenomik till $100 – 1000 per test, skulle det kräva 2,5-4 gånger det diagnostiska utbytet av datortomografi av buken och bäckenet för att vara kostnadsneutrala och varnade för "utbredd brådska" att sätta in metagenomiska tester.

I fallet med upptäckten av potentiella nya smittämnen publiceras vanligtvis bara de positiva resultaten även om den stora majoriteten av sekvenserade fall är negativa, vilket resulterar i mycket partisk information. Dessutom nämnde det mesta av upptäcktsarbetet baserat på metagenomik som föregår det diagnostiska arbetet till och med de kända ämnen som upptäckts vid screening av olösta fall för helt nya orsaker.

Laboratorievaliditet

Hittills har de flesta publicerade tester körts på ett ovaliderat, ej rapporterbart sätt. Den "standardmikrobiologiska testning" som prover utsätts för före metagenomik är variabel och har inte inkluderat av omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (RT-PCR) för vanliga luftvägsvirus eller rutinmässigt 16S/ITS PCR-testning.

Med tanke på de relativa kostnaderna för att validera och utföra metagenomisk kontra 16S/ITS PCR-testning anses den andra vara ett enklare och mer effektivt alternativ. Ett potentiellt undantag från 16S/ITS-testningen är blod, med tanke på den enorma mängden 16S-sekvens som finns tillgänglig, vilket gör rena cutoffs för diagnostiska ändamål problematiska.

Dessutom kan nästan alla organismer som upptäcks av metagenomik för vilka det finns en associerad behandling och som därför verkligen skulle kunna utföras också detekteras med 16S/ITS-testning (eller 16S/ITS-NGS). Detta gör det tveksamt om användbarheten av metagenomik i många diagnostiska fall.

En av huvudpunkterna för att uppnå laboratorievaliditet är närvaron av referensstandarder och kontroller när man utför mNGS-analyser. De behövs för att säkerställa kvaliteten och stabiliteten hos denna teknik över tid.

Sinne och känslighet

I kliniska mikrobiologilaborationer anses kvantifieringen av mikrobiell börda vara en rutinfunktion eftersom den är förknippad med sjukdomens svårighetsgrad och progression. För att uppnå en bra kvantifiering krävs en hög känslighet hos tekniken.

Medan störande substanser utgör ett vanligt problem för klinisk kemi eller PCR-diagnostik, är graden av interferens från värd (till exempel i vävnadsbiopsier ) eller icke-patogena nukleinsyror (till exempel i avföring) i metagenomik en ny vändning. Dessutom, på grund av den relativa storleken av det mänskliga genomet i jämförelse med mikrobiella genom, kan interferensen inträffa vid låga nivåer av kontaminerande material.

En annan utmaning för klinisk metagenomik när det gäller känslighet är diagnosen av koinfektioner där det finns patogener med hög titer som kan generera partiska resultat eftersom de oproportionerligt kan suga upp läsningar och göra det svårt att särskilja de mindre dominerande patogenerna.

Förutom problem med störande substanser, speciellt inom diagnosområdet, är noggrann kvantifiering och känslighet avgörande eftersom en förvirring i resultaten kan påverka en tredje person, patienten. Av dessa skäl måste utövare för närvarande vara mycket medvetna om problem med indexbyte i samband med Illumina-sekvensering som kan leda till spårning av felaktigt streckkodade prover.

Eftersom metagenomics vanligtvis har använts på patienter för vilka vartannat test hittills har varit negativt, har frågor kring analytisk känslighet varit mindre relevanta. Men för att utesluta infektionsorsaker som en av de viktigare rollerna för klinisk metagenomik är det viktigt att kunna utföra en tillräckligt djup sekvensering för att uppnå adekvat känslighet. Ett sätt kan vara att utveckla nya biblioteksförberedande tekniker.

Kostnadsöverväganden

Från och med 2018 har Illumina-monopolet på högkvalitativa nästa generations sekvenseringsreagens inneburit att enbart sekvenseringsreagenserna kostar mer än FDA- godkända syndromtestpaneler. Även ytterligare direkta kostnader för metagenomik såsom extraktion, biblioteksförberedelse och beräkningsanalys måste beaktas. I allmänhet är metagenomisk sekvensering mest användbar och kostnadseffektiv för patogener när minst ett av följande kriterier är uppfyllt:

  1. identifieringen av organismen är inte tillräcklig (man vill gå bortom upptäckten för att producera data för genomisk karakterisering),
  2. en saminfektion misstänks,
  3. andra enklare analyser är ineffektiva eller kommer att ta orimligt lång tid,
  4. screening av miljöprover för tidigare obeskrivna eller divergerande patogener.

Se även

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Clinical_metagenomic_sequencing&oldid=1128166481 "