Katekoloxidas
| Katekoloxidasidentifierare | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| _ | |||||||||
| EG nr. | 1.10.3.1 | ||||||||
| CAS-nr. | 9002-10-2 | ||||||||
| Databaser | |||||||||
| IntEnz | IntEnz-vy | ||||||||
| BRENDA | BRENDA inträde | ||||||||
| ExPASy | NiceZyme-vy | ||||||||
| KEGG | KEGG inträde | ||||||||
| MetaCyc | Metabolisk väg | ||||||||
| PRIAM | profil | ||||||||
| PDB- strukturer | RCSB PDB PDBe PDB summa | ||||||||
| |||||||||
Katekoloxidas är ett kopparoxidas som innehåller en typ 3 di-kopparkofaktor och katalyserar oxidationen av orto- difenoler till ortokinoner i kombination med reduktion av molekylärt syre till vatten. Det finns i en mängd olika arter av växter och svampar inklusive Ipomoea batatas ( sötpotatis ) och Camellia sinensis (indiskt teblad). Metalloenzymer med kopparcentra typ 3 kännetecknas av deras förmåga att reversibelt binda dioxygen vid omgivande förhållanden. I växter spelar katekoloxidas en nyckelroll i enzymatisk brunfärgning genom att katalysera oxidationen av katekol till o-kinon i närvaro av syre, som snabbt kan polymerisera och bilda melanin som ger skadade frukter deras mörkbruna färg.
Biologisk funktion
Polyfenoloxidaser är en familj av di-kopparmetalloenzymer som inkluderar tyrosinas och katekoloxidas. I växter kan båda enzymerna katalysera oxidationen av orto-difenolsubstrat till deras motsvarande ortokinoner. Den viktigaste skillnaden mellan de två relaterade enzymerna är att tyrosinas kan katalysera hydroxyleringen av monofenoler till difenoler (monofenolasaktivitet) såväl som oxidationen av o-difenolen till o-kinonen (difenolasaktivitet), medan katekoloxidas endast har difenolasaktivitet.
När växtvävnad är skadad kan kloroplasten brista och frigöra katekoloxidas i växtcytoplasman, och vakuoler kan också brista, vilket frisätter lagrad katekol i cytoplasman. Vävnadsskadan tillåter också syre att tränga in i cellen. Sålunda underlättar vävnadsskada interaktionen av katekoloxidas med dess substrat för att producera o-bensokinon, som kan polymerisera icke-enzymatiskt för att ge melaniner som bildar en olöslig barriär för sårskydd.
Proteolytisk bearbetning
Katekoloxidas är nukleärt kodat och dess N-terminala ände innehåller en signalpeptid som leder proteinet till kloroplasttylakoidlumen, där det antingen kan vara lösligt eller löst associerat med tylakoidmembranet. Initialt transkriberat som ett proenzym , genomgår katekoloxidasprekursorn två omgångar av proteolytisk bearbetning och transport innan den kommer in i tylakoidlumen.
Genom att använda ett [ 35S ]-metioninmärkt prekursorprotein, Sommer et al. belyst en proteolytisk processväg som är gemensam för en mängd olika växter inklusive ärter ( Pisum sativum ), tomat ( Lycopersicon esculentum ) och majs ( Zea mays ). 67 kD-prekursorn importerades till stroma på ett ATP -beroende sätt där ett stromalt peptidas bearbetar prekursorn till en 62 kD-intermediär. Translokationen av denna intermediär till tylakoidlumen var ljusberoende och resulterar i generering av det mogna 59 kD enzymet. Baserat på analys av prekursorn och moget katekoloxidas renat från Ipomoea batatas , tar proteolytisk bearbetning bort både den N-terminala transitpeptiden såväl som en C-terminal domän som täcker enzymets aktiva plats.
Enzymstruktur
Kristallstrukturen av katekoloxidas renat från Ipomoea batatas har lösts upp i sin aktiva form i både det oxiderade Cu(II)-Cu(II)-tillståndet och det reducerade Cu(I)-Cu(I)-tillståndet . Det är ett klotformigt monomert enzym med en domän som är ungefär 55 gånger 45 gånger 45 Å stort och ellipsoid i form. En bunt med fyra α-helixer omfattar enzymkärnan, som omger det aktiva stället som innehåller dikopparcentrum. Kväveatomerna på imidazolsidokedjorna av His 88, His109 och His118 koordinerar med den första katalytiska kopparn medan kväveatomerna på imidazolsidokedjorna på His240, His244 och His274 koordinerar med den andra katalytiska kopparjonen. I det oxiderade Cu(II)-Cu(II)-tillståndet har varje kopparjon en trigonal pyramidgeometri med fyra koordinater, med de tre histidinresterna och en överbryggande hydroxidmolekyl som bildar de fyra liganderna på varje kopparjon. Om man jämför det reducerade (Cu(I)-Cu(I)) tillståndet med det naturliga (Cu(II)-Cu(II)) tillståndet för enzymet, är den viktigaste skillnaden avståndet mellan de två kopparcentra. I det oxiderade Cu(II)-Cu(II)-tillståndet är Cu-Cu-avståndet 3,3 Å medan i det reducerade Cu(I)-Cu(I)-tillståndet ökar avståndet till 4,4 Å.
Medan det aktiva stället för både tyrosinas och katekoloxidas innehåller di-kopparcentrum, resulterar variationer i varje enzyms respektive struktur i olika aktivitet. I katekoloxidas är en fenylalaninsidokedja (Phe261) ovanför ett av kopparcentrumen och förhindrar substratet från att koordinera med båda kopparjonerna i det aktiva stället. Detta utesluter det bidentata koordinationskomplexet som är nödvändigt för di-fenolathydroxylering som är karakteristisk för tyrosinas men saknas i katekoloxidas. Vidare är His109 bunden till ett av kopparcentra också kovalent kopplat till Cys192 genom en tioeterbrygga . Denna cystein-histidin-tvärbindning kan ytterligare hindra det enzymaktiva stället från att anta det bidentata koordinationskomplexet som lätt bildas i tyrosinas.
Katalytisk cykel och mekanism
Även om en kristallstruktur av katekoloxidas har lösts kvarstår frågor om den exakta mekanismen för reaktionen. En mekanism föreslagen av Eicken et al. är baserad på kristallstrukturen hos katekoloxidas renat från Ipomoea batatas . Den katalytiska cykeln börjar med katekoloxidaset i dess naturliga oxiderade Cu(II)-Cu(II)-tillstånd med en koordinerad hydroxidjon som överbryggar de två kopparcentra. När katekol kommer in i det aktiva stället , abstraheras en proton från en av alkoholerna. Katekolen koordinerar med ett Cu(II)-centrum på ett monodentat sätt, och ersätter en av de koordinerande histidinresterna. Den koordinerade hydroxidjonen abstraherar en annan proton från katekol för att bilda vatten, och katekolen oxideras till o-kinon. De två resulterande elektronerna reducerar båda kopparcentra till deras Cu(I)-Cu(I)-tillstånd. Dioxygen binder sedan ett kopparcentrum och ersätter den koordinerade vattenmolekylen, och en annan katekolmolekyl binder till det andra kopparcentret och ersätter en annan histidinrest. Detta bildar ett komplex där ett kopparcentrum har en tetragonal plan koordination med His240, His244 och dioxygenmolekylen. Det andra kopparcentret behåller sin initiala tetragonala pyramidalgeometri med dioxygen, His88 och His118 i ekvatorpositionerna och His109 i en axiell position. I detta tillstånd är enzymets aktiva ställe i ett ternärt katekoloxidas–O 2 2−– katekolkomplex. Två elektroner överförs från substratet till dioxygenet, följt av klyvning av O–O-bindningen. Vatten frigörs och den andra o-kinonprodukten bildas tillsammans med återställandet av det initiala Cu(II)-Cu(II)-tillståndet för att fullborda den katalytiska cykeln.
Denna föreslagna katalytiska cykel stöds av den experimentella observationen att stökiometriska mängder av o-kinon bildas efter katekoltillsats till enzymet, även när dioxygen saknas. Dessutom var både det oxiderade Cu(II)-Cu(II)-tillståndet och det reducerade Cu(I)-Cu(I)-tillståndet de två tillstånden som identifierades av kristallstrukturen hos Ipomoea batatas . Den monodentata bindningen av katekol till kopparcentrumet stöddes av kristallstrukturen av katekoloxidas bundet med den bundna substratanaloginhibitorn fenyltiourea , som också binder till kopparcentrumet på ett monodentat sätt. Ett problem med denna katalytiska cykel är dock att laddningen av den aktiva platsen ändras under den katalytiska cykeln från +1 till +3. Detta nödvändiggör närvaron av närliggande baser som kan lagra protonerna; emellertid indikerar röntgenkristallstrukturen inte närvaron av några sådana baser eftersom histidinresterna är koordinerade med kopparcentra. Andra katalytiska cykler belysta med DFT-beräkningar och kristallstrukturer har föreslagits som bibehåller samma laddning i det aktiva stället under hela cykeln och därför inte kräver närliggande baser. Vissa intermediärer i den föreslagna cykeln överensstämmer emellertid inte med experimentella fynd såsom att stökiometriska mängder av o-kinon kan bildas efter katekoltillsats i frånvaro av syre.
Ekonomisk och industriell relevans
Oxidationen av fenolsubstrat till deras motsvarande kinoner är den primära orsaken till att frukt och grönsaker brunnar under mognad, hantering och bearbetning. Enzymatisk brunfärgning påverkar näringskvaliteten och utseendet på frukter och produkter. Över hälften av fruktförlusterna uppskattas uppstå som ett resultat av enzymatisk brunfärgning, och tropiska produkter är särskilt känsliga för denna reaktion. Förlusten av näringsämnen kan uppstå på grund av interaktionen mellan kinoner, som produceras genom oxidation av difenoler, med sidokedjorna av essentiella aminosyror som härrör från växtproteiner. I synnerhet tiol- och aminfunktionella grupper på aminosyrornas sidokedjor mycket känsliga för kinonbindning och alkylering. Katekoloxidas nyckelroll i enzymatisk brunfärgning gör det till ett vanligt mål för hämning. Medan ett antal hämmande strategier existerar såsom högtemperaturbehandlingar (70-90 °C) för att eliminera katekoloxidas katalytisk aktivitet, är en populär strategi att sänka pH med citronsyra . Katekoloxidas är mer katalytiskt aktivt i pH 4-8-intervallet på grund av koordinering av histidinresterna till de katalytiska kopparcentra. Användningen av syror som citronsyra för att sänka pH under detta optimala intervall minskar bindningen av enzymet till dess aktiva kopparställe eftersom protoneringen av histidinrester stör deras förmåga att koordinera med kopparcentra.
Konstgjorda enzymer
Nya tillvägagångssätt för att designa artificiella enzymer baserade på aminosyror eller peptider som karakteristiska molekylära delar har lett till en betydande expansion av området för artificiella enzymer eller enzymhärmare. Nyligen genomförda resultat av gruppen Rob Liskamp har visat att histidinrester i byggnadsställningar kan användas som efterliknande av vissa metalloproteiner och -enzymer. Den strukturella mimiken av vissa kopparproteiner (t.ex. hemocyanin , tyrosinas och katekoloxidas), som innehåller kopparbindningsställen av typ 3, har visats. Detta är en betydande förbättring eftersom användningen av byggnadsställningar histidinrester är ett steg närmare efterlikningen av enzymer av biologiskt relevanta arter.
externa länkar
- Catechol+Oxidase vid US National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH)
