Inducerad cellcykelstopp
Inducerad cellcykelstopp är användningen av en kemisk eller genetisk manipulation för att artificiellt stoppa progression genom cellcykeln . Cellulära processer som genomduplicering och celldelning upphör. Det kan vara tillfälligt eller permanent. Det är en artificiell aktivering av naturligt förekommande cellcykelkontrollpunkter , inducerad av exogena stimuli kontrollerade av en experimentator.
Modellorganismer
I ett akademiskt forskningssammanhang utförs cellcykelstopp vanligtvis i modellorganismer och cellextrakt, såsom Saccharomyces cervisiae (jäst) eller Xenopus oocyter (grodägg). Grodäggcellextrakt har använts flitigt i cellcykelforskning eftersom de är relativt stora, når en diameter på 1 mm, och därför innehåller stora mängder protein, vilket gör proteinnivåerna lättare att mäta.
Syften
Det finns en mängd olika anledningar till att en forskare kan vilja tillfälligt eller permanent förhindra framsteg genom cellcykeln.
Cellcykelsynkronisering
I vissa experiment kan en forskare vilja kontrollera och synkronisera tiden när en grupp celler går vidare till nästa fas av cellcykeln. Cellerna kan induceras att stanna när de anländer (vid olika tidpunkter) vid en viss fas, så att när arresteringen hävs (till exempel rädda cellcykelprogression genom att introducera en annan kemikalie) återupptar alla celler cellcykelprogression vid samma tid. Förutom att denna metod fungerar som en vetenskaplig kontroll för när cellerna återupptar cellcykeln, kan denna användas för att undersöka nödvändighet och tillräcklighet .
En annan anledning till att synkronisering är viktig är kontrollen av mängden DNA-innehåll, som varierar i olika delar av cellcykeln baserat på om DNA-replikation har skett sedan den senaste omgången av avslutad mitos och cytokines.
Dessutom möjliggör synkronisering av ett stort antal celler i samma fas insamling av tillräckligt stora grupper av celler i samma cykel för användning i andra analyser, såsom western blot och RNA-sekvensering .
Reparation av DNA-skador
Forskare kan undersöka mekanismer för reparation av DNA-skador . Med tanke på att några av mekanismerna nedan för att inducera cellcykelstopp innebär att DNA skadas, tillåter detta undersökning av hur cellen reagerar på skada på sitt genetiska material.
Identifiering av in vivo proteinfunktion
Genteknik av celler med specifika genknockouts kan också resultera i celler som stannar vid olika faser av cellcykeln. Exempel inkluderar:
- G1 : Saccharomyces cerevisiae -jäst som uttrycker dominanta mutanta alleler av CDC28- stopp i G1 , vilket indikerar att CDC28 är nödvändigt för passage bortom G1- fasen .
- S: Schizosaccharomyces pombe (klyvningsjäst) som uttrycker en temperaturkänslig mutant form av DNA-polymeras delta (pol delta ts03) stopp i S-fas.
- G 2 : Fissionsjäst som uttrycker vissa muterade former av CDC2 som inte kan stoppas i G 2 som svar på DNA-skada, vilket indikerar att genprodukten är involverad i G 2 -stopp.
- M: En mutant screening av spirande jästsvampar med mitotiskt stopp identifierade CDC16 , CDC23 och CDC27 som nyckelgener som, när de muteras, orsakar stopp i mitos.
G 1 fasstopp
G 1 -fasen är den första av de fyra faserna i cellcykeln och är en del av interfas . I G 1 syntetiserar cellen budbärar-RNA (mRNA) och proteiner som förberedelse för efterföljande steg av interfas som leder till mitos. I mänskliga somatiska celler varar cellcykeln cirka 18 timmar, och G 1 -fasen utgör cirka 1/3 av den tiden. Å andra sidan, i groda-, sjöborre- och fruktflugembryon är G 1 -fasen extremt kort och är istället ett litet gap mellan cytokines och S-fasen.
Alfafaktor
α-faktor är ett feromon som utsöndras av Saccharomyces cervisiae som stoppar jästcellerna i G 1 -fas. Det gör det genom att hämma enzymet adenylatcyklas . Enzymet katalyserar omvandlingen av adenosintrifosfat (ATP) till 3',5'-cyklisk AMP (cAMP) och pyrofosfat .
Kontakthämning
Kontakthämning är en metod för att stoppa celler när närliggande celler kommer i kontakt med varandra. Det resulterar i ett enda lager av arresterade celler av arresterade celler, och är en process som särskilt saknas i cancerceller . Den misstänkta mekanismen är beroende av p27 Kip1 , en cyklinberoende kinashämmare . p27 Kip1 proteinnivåer är förhöjda i arresterande celler. Denna naturliga process kan efterliknas i ett labb genom överuttryck av p27 Kip1 , vilket resulterar i inducerad cellcykelstopp i G 1 -fasen.
Mimosine
Mimosin är en växtaminosyra som har visat sig reversibelt hämma progression bortom G 1 -fasen i vissa mänskliga celler, inklusive lymfoblastoidceller . Dess föreslagna verkningsmekanism är en järn/zink- kelator som utarmar järn i cellen. Detta inducerar dubbelsträngsbrott i DNA, vilket hämmar DNA-replikation. Detta kan innebära blockering av verkan av ett järnberoende ribonukleotidreduktas . Det kan också hämma transkriptionen av serinhydroximetyltransferas , som har zinkberoende.
Serumbrist
I cellodling är serum det tillväxtmedium som cellerna odlas i och innehåller livsviktiga näringsämnen. Användningen av serumbrist - delvis eller helt avlägsnande av serumet och dess näringsämnen - har visat sig stoppa och synkronisera cellcykelprogression i 0 G -fasen , till exempel i neonatala däggdjursastrocyter och humana förhudsfibroblaster .
Aminosyrasvält är ett liknande tillvägagångssätt. När de odlas i ett medium utan några essentiella aminosyror, såsom metionin , stannar vissa celler i tidig G 1 -fas.
S fasstopp
S-fasen följer G 1 -fasen via G 1 /S-övergången och föregår G 2 -fasen i interfas och är den del av cellcykeln i vilken DNA replikeras. Eftersom noggrann duplicering av genomet är avgörande för framgångsrik celldelning, är de processer som sker under S-fasen hårt reglerade och allmänt bevarade. Pre-replikationskomplex som satts ihop före S-fasen omvandlas till aktiva replikeringsgafflar . Att driva denna omvandling är Cdc7 och S-fas cyklinberoende kinaser , som båda är uppreglerade efter G 1 /S-övergången.
Aphidicolin
Aphidicolin är ett antibiotikum isolerat från svampen Cephalosporum aphidicola . Det är en reversibel hämmare av eukaryot nukleär DNA-replikation som blockerar progression förbi S-fasen. Dess mekanism är hämningen av DNA-polymeras A och D . En strukturell studie fann att detta tros ske genom att binda polymerasets alfaaktiva ställe och "rotera mallen guanin", vilket förhindrar deoxycytidintrifosfat (dCTP) från att binda. Detta S-fasblock inducerar apoptos i HeLa -celler.
Hydroxyurea
Hydroxyurea (HU) är ett läkemedel med små molekyler som hämmar enzymet ribonukleotidreduktas (RNR), vilket förhindrar katalys av omvandling av deoxiribonukleotider (DNT) till ribonukleotider . Det antas att det finns tyrosylfri radikal inom RNR som är inaktiverad av HU. De fria radikalerna är nödvändiga för att minska DNT och rensas istället av HU. HU har visat sig stoppa celler i både S-fas (friska celler) och omedelbart före cytokines (mutanta celler).
2,3-DCPE
2[[3-(2,3-diklorfenoxi)propyl]amino]etanol (2,3-DCPE) är en liten molekyl som inducerar S-fasstopp. Detta visades i cancercellinjer och nedreglerar uttrycket av B-cellslymfom-extra large ( Bcl-XL ), ett anti-apoptotiskt protein som förhindrar frisättning av mitokondrieinnehåll som cytokrom c .
G 2 fasstopp
G 2 -fasen är den sista delen av interfasen och föregår direkt mitos. Det kommer endast att föras in i vanliga celler om DNA-replikationen i S-fas slutförs framgångsrikt. Det är en period av snabb celltillväxt och proteinsyntes under vilken cellen förbereder sig för mitos.
Förstörelse av cyklin-mRNA
Cykliner är proteiner som kontrollerar progression genom cellcykeln genom att aktivera cyklinberoende kinaser. Förstörelse av en cells endogena cyklinbudbärar-RNA kan stoppa grodäggsextrakt i interfas och hindra dem från att gå in i mitos. Införande av exogent cyklin-mRNA är också tillräckligt för att rädda cellcykelprogression. En metod för denna destruktion är genom användning av antisensoligonukleotider , RNA-bitar som binder till cyklin-mRNA:t och förhindrar att mRNA:t översätts till cyklinprotein. Detta kan faktiskt användas för att förstöra fasspecifika cykliner bortom bara G 2 - till exempel förhindrar förstörelse av cyklin D1 -mRNA av antisensoligonukleotider progression från G 1 -fas till S-fas.
Mitotisk arrestering
Mitos är den sista delen av cellcykeln och följer interfas. Den består av fyra faser - profas , metafas , anafas och telofas - och involverar kondensering av kromosomerna i kärnan , upplösning av kärnhöljet och separation av systerkromatider med spindelfibrer . När mitosen avslutas försvinner spindelfibrerna och kärnmembranet reformeras runt var och en av de två uppsättningarna av kromosomer. Efter framgångsrik mitos delas cellen fysiskt i två identiska dotterceller i en process som kallas cytokinesis , och detta avslutar en hel omgång av cellcykeln. Var och en av dessa nya celler skulle sedan potentiellt kunna gå in i G 1 -fasen igen och börja cellcykeln igen.
Nocodazol
Nocodazol är ett kemiskt medel som stör polymerisationen av mikrotubuli. Celler som behandlats med nocodazol arresterar med DNA-innehåll i G 2 eller M-fas, vilket kan verifieras med flödescytometri. Från mikroskopi har det fastställts att de går in i mitos men de kan inte bilda de spindlar som behövs för metafas eftersom mikrotubulierna inte kan polymerisera. Forskning om mekanismen har antytt att det potentiellt hindrar tubulin från att bilda sin alfa/beta-heterodimer.
Taxol
Taxol fungerar på motsatt sätt av nocodazol, istället stabiliserar mikrotubulipolymeren och förhindrar att den demonteras. Det orsakar också M-fasstopp, eftersom spindeln som är tänkt att dra isär systerkromatider inte kan demonteras. Det verkar genom ett specifikt bindningsställe på mikrotubulipolymeren och kräver som sådan inte GTP eller andra kofaktorer för att inducera tubulinpolymerisation.
Temperatur
Temperatur har visat sig reglera HeLa cellcykelprogression. Mitos visade sig vara den mest temperaturkänsliga delen av cellcykeln. Pre-cytokinesis mitotisk stopp var synligt genom ackumulering av celler i mitos i temperaturer under normala mellan 24 och 31 °C (75,2-87,8 °F).
Verifiering
Det finns flera metoder som kan användas för att verifiera att celler har arresterats i rätt fas.
Flödescytometri
Flödescytometri är en teknik för att mäta fysiska och kemiska egenskaper hos en population av celler med hjälp av lasrar och fluoroforfärgämnen som är kovalent kopplade till proteinmarkörer. Ju starkare signalen är, desto mer av ett visst protein är närvarande. Färgning med DNA-färgämnen propidiumjodid eller 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) möjliggör avgränsning eller sortering av celler mellan G 1, S eller G 2 /M faser.
Immunblotting
Immunblotting är detektion av specifika proteiner i ett vävnadsprov eller extrakt. Primära antikroppar känner igen och binder proteinet i fråga och sekundära antikroppar tillsätts som känner igen de primära antikropparna. Den sekundära antikroppen visualiseras sedan genom färgning eller immunfluorescens , vilket möjliggör indirekt detektering av det ursprungliga målproteinet.
Immunblotting kan utföras för att detektera närvaron av cykliner , proteiner som reglerar cellcykeln. Olika klasser av cykliner är upp- och nedreglerade i olika delar av cellcykeln. Mätning av cyklinerna från ett extrakt av en arresterad cell kan avgöra vilken fas cellen befinner sig i. Till exempel skulle en topp av cyklin E -protein indikera G 1 /S-övergången , en cyklin A -topp skulle indikera sen G 2 -fas, och en cyklin B- topp skulle indikera mitos.
Fluorescens ubiquitination-baserad cellcykelindikation (FUCCI)
FUCCI är ett system som drar fördel av cellcykelfasspecifikt uttryck av proteiner och deras nedbrytning av ubiquitin-proteasomvägen . Två fluorescerande prober - Cdt1 och Geminin konjugerade till fluorescerande proteiner - möjliggör realtidsvisualisering av cellcykelfasen en cell befinner sig i.