Immunfluorescens

Mikrofotografi av en histologisk sektion av mänsklig hud preparerad för direkt immunfluorescens med användning av en anti-IgA-antikropp. Huden är från en patient med Henoch–Schönlein purpura : IgA-avlagringar finns i väggarna på små ytliga kapillärer (gula pilar). Det ljust vågiga gröna området på toppen är epidermis , det nedre fibrösa området är dermis .
Diagram över primär och sekundär immunofluorescens: Primär immunofluorescens involverar en antikropp med en fluorofor som avger en signal när den en gång är bunden till en specifik antigens epitop. Sekundär immunfluorescens har en sekundär antikropp med en fluorofor som binder en primär antikropp som är specifik för antigenets epitop.

Immunfluorescens är en teknik som används för ljusmikroskopi med fluorescensmikroskop och används främst på biologiska prover . Denna teknik använder specificiteten hos antikroppar mot deras antigen för att rikta fluorescerande färgämnen till specifika biomolekylmål i en cell, och tillåter därför visualisering av fördelningen av målmolekylen genom provet. Den specifika region en antikropp känner igen på ett antigen kallas en epitop . Det har gjorts försök med epitopkartläggning eftersom många antikroppar kan binda samma epitop och bindningsnivåer mellan antikroppar som känner igen samma epitop kan variera. Dessutom kan bindningen av fluoroforen till antikroppen i sig inte störa antikroppens immunologiska specificitet eller bindningskapaciteten hos dess antigen. Immunfluorescens är ett allmänt använt exempel på immunfärgning (användning av antikroppar för att färga proteiner) och är ett specifikt exempel på immunhistokemi (användningen av antikropp-antigen-förhållandet i vävnader). Denna teknik använder i första hand fluoroforer för att visualisera platsen för antikropparna.

Immunfluorescens kan användas på vävnadssnitt, odlade cellinjer eller enskilda celler och kan användas för att analysera fördelningen av proteiner , glykaner och små biologiska och icke-biologiska molekyler. Denna teknik kan till och med användas för att visualisera strukturer som filament av mellanstor storlek. Om topologin för ett cellmembran ännu inte har bestämts, kan epitopinsättning i proteiner användas i samband med immunfluorescens för att bestämma strukturer. Immunfluorescens kan också användas som en "semi-kvantitativ" metod för att få insikt i nivåerna och lokaliseringsmönster för DNA-metylering eftersom det är en mer tidskrävande metod än riktiga kvantitativa metoder och det finns en viss subjektivitet i analysen av nivåerna av metylering. Immunfluorescens kan användas i kombination med andra icke-antikroppsmetoder för fluorescerande färgning, till exempel användning av DAPI för att märka DNA . Flera mikroskopdesigner kan användas för analys av immunofluorescensprover; det enklaste är epifluorescensmikroskopet , och det konfokala mikroskopet används också flitigt. Olika superupplösta mikroskopdesigner som kan ha mycket högre upplösning kan också användas.

Typer

Mikrofotografi av en histologisk sektion av mänsklig hud preparerad för direkt immunfluorescens med användning av en anti-IgG-antikropp. Huden är från en patient med systemisk lupus erythematosus och visar IgG-avlagring på två olika ställen: Den första är en bandliknande avlagring längs epidermal basalmembran ("lupusbandtest" är positivt). Den andra är inom kärnorna i epidermala celler (anti-nukleära antikroppar).

Beredning av fluorescens

För att göra fluorokrommärkta antikroppar måste en fluorokrom konjugeras ("taggad") till antikroppen. På samma sätt kan ett antigen också konjugeras till antikroppen med en fluorescerande sond i en teknik som kallas fluorescerande antigenteknik. Färgningsprocedurer kan gälla både fixerade antigen i cytoplasman eller cellyteantigener på levande celler, så kallad "membranimmunfluorescens". Det är också möjligt att märka komplementet av antikropp-antigenkomplexet med en fluorescerande sond. Förutom elementet till vilket fluorescenssonder är fästa, finns det två allmänna klasser av immunfluorescenstekniker: primära och sekundära. Följande beskrivningar kommer primärt att fokusera på dessa klasser i termer av konjugerade antikroppar.

Det finns två klasser av immunfluorescenstekniker, primär (eller direkt) och sekundär (eller indirekt).

Primär (direkt)

Primär (direkt) immunfluorescens använder en enda, primär antikropp, kemiskt kopplad till en fluorofor . Den primära antikroppen känner igen målmolekylen (antigenet) och binder till en specifik region som kallas epitopen. Detta åstadkoms genom en process som manipulerar immunsvaret hos organismer med adaptiv immunitet. Den bifogade fluoroforen kan detekteras via fluorescerande mikroskopi, som, beroende på vilken budbärare som används, kommer att avge en specifik våglängd av ljus när den en gång exciteras. Direkt immunofluorescens, även om det är något mindre vanligt, har anmärkningsvärda fördelar jämfört med den sekundära (indirekta) proceduren. Den direkta fästningen av budbäraren till antikroppen minskar antalet steg i proceduren, vilket sparar tid och minskar ospecifik bakgrundssignal. Detta begränsar också möjligheten till korsreaktivitet av antikroppar och möjliga misstag under hela processen. Det finns dock vissa nackdelar med denna metod. Eftersom antalet fluorescerande molekyler som kan bindas till den primära antikroppen är begränsat, är direkt immunfluorescens väsentligt mindre känslig än indirekt immunofluorescens och kan resultera i falska negativ. Direkt immunfluorescens kräver också användning av mycket mer primär antikropp, vilket är extremt dyrt, ibland upp till 400,00 USD/ml.

Sekundär (indirekt)

En fluorescerande fläck för aktin i hudens glatta muskulatur .

Sekundär (indirekt) immunfluorescens använder två antikroppar; den omärkta första (primära) antikroppen binder specifikt målmolekylen, och den sekundära antikroppen, som bär fluoroforen, känner igen den primära antikroppen och binder till den. Flera sekundära antikroppar kan binda en enda primär antikropp. Detta ger signalförstärkning genom att öka antalet fluoroformolekyler per antigen. Detta protokoll är mer komplext och tidskrävande än det primära (eller direkta) protokollet ovan, men tillåter mer flexibilitet eftersom en mängd olika sekundära antikroppar och detektionstekniker kan användas för en given primär antikropp.

Detta protokoll är möjligt eftersom en antikropp består av två delar, en variabel region (som känner igen antigenet) och konstant region (som utgör strukturen av antikroppsmolekylen). Det är viktigt att inse att denna uppdelning är artificiell och i verkligheten är antikroppsmolekylen fyra polypeptidkedjor: två tunga kedjor och två lätta kedjor. En forskare kan generera flera primära antikroppar som känner igen olika antigener (har olika variabla regioner), men som alla delar samma konstanta region. Alla dessa antikroppar kan därför kännas igen av en enda sekundär antikropp. Detta sparar kostnaden för att modifiera de primära antikropparna för att direkt bära en fluorofor.

Olika primära antikroppar med olika konstanta regioner genereras vanligtvis genom att höja antikroppen i olika arter. Till exempel kan en forskare skapa primära antikroppar i en get som känner igen flera antigener och sedan använda färgämneskopplade sekundära kaninantikroppar som känner igen getantikroppens konstanta region ("kanin-anti-get"-antikroppar). Forskaren kan sedan skapa en andra uppsättning primära antikroppar i en mus som kan kännas igen av en separat sekundär "åsna-anti-mus"-antikropp. Detta möjliggör återanvändning av de svårtillverkade färgämneskopplade antikropparna i flera experiment.

Begränsningar

Som med de flesta fluorescenstekniker är ett betydande problem med immunfluorescens fotoblekning . Förlust av aktivitet orsakad av fotoblekning kan kontrolleras genom att minska eller begränsa intensiteten eller tidsperioden för ljusexponering, genom att öka koncentrationen av fluoroforer eller genom att använda mer robusta fluoroforer som är mindre benägna att bleka (t.ex. Alexa Fluors , Seta Fluors eller DyLight Fluors ). Vissa problem som kan uppstå från denna teknik inkluderar autofluorescens, oönskad oönskad specifik fluorescens och ospecifik fluorescens. Autofluorescens inkluderar fluorescens som emitteras från provvävnaden eller själva cellen. Oönskad oönskad specifik fluorescens uppstår när ett riktat antigen är orent och innehåller antigena föroreningar. Ospecifik fluorescens innebär förlust av en sonds specificitet på grund av fluorofor, från felaktig fixering eller från ett uttorkat prov.

Immunfluorescens är endast begränsad till fixerade (dvs döda) celler när strukturer i cellen ska visualiseras eftersom antikroppar inte penetrerar cellmembranet när de reagerar med fluorescerande märkningar. Antigent material måste fixeras ordentligt på platsen för dess naturliga lokalisering inuti cellen. Intakta antikroppar kan också vara för stora för att färga cancerceller in vivo . Deras storlek resulterar i långsam tumörpenetration och lång cirkulerande halveringstid. Forskning har gjorts för att undersöka användningen av diakroppar för att komma runt denna begränsning. Proteiner i supernatanten eller på utsidan av cellmembranet kan bindas av antikropparna; detta gör att levande celler kan färgas. Beroende på vilket fixativ som används kan proteiner av intresse bli tvärbundna och detta kan resultera i antingen falskt positiva eller falskt negativa signaler på grund av ospecifik bindning.

Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda rekombinanta proteiner som innehåller fluorescerande proteindomäner, t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP). Användning av sådana "taggade" proteiner tillåter bestämning av deras lokalisering i levande celler. Även om detta verkar vara ett elegant alternativ till immunfluorescens, måste cellerna transfekteras eller transduceras med GFP-taggen, och som en konsekvens blir de åtminstone S1 eller högre organismer som kräver strängare säkerhetsstandarder i ett laboratorium. Denna teknik innebär att cellers genetiska information förändras.

Framsteg

Många förbättringar av denna metod ligger i förbättringen av fluorescerande mikroskop och fluoroforer. Superupplösningsmetoder hänvisar i allmänhet till ett mikroskops förmåga att producera upplösning under Abbe-gränsen (en gräns för ljus på grund av dess våglängd). Denna diffraktionsgräns är cirka 200-300 nm i lateral riktning och 500-700 nm i axiell riktning. Denna gräns är jämförbar eller större än vissa strukturer i cellen, och följaktligen hindrade denna gräns forskare från att fastställa detaljer i deras struktur. Superupplösning i fluorescens, mer specifikt, hänvisar till förmågan hos ett mikroskop att förhindra samtidig fluorescens av intilliggande spektralt identiska fluoroforer. Denna process skärper effektivt mikroskopets punktspridningsfunktion. Exempel på nyligen utvecklade superupplösta fluorescerande mikroskopmetoder inkluderar stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi, mättad strukturerad belysningsmikroskopi (SSIM), fluorescensfotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (FPALM) och stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM).

Anmärkningsvärda människor

Se även

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Immunofluorescence&oldid=1137352940 "