Genterapi av den mänskliga näthinnan
Retinal genterapi har ett löfte vid behandling av olika former av icke-ärvd och ärftlig blindhet .
2008 rapporterade tre oberoende forskargrupper att patienter med den sällsynta genetiska näthinnesjukdomen Lebers medfödda amauros hade framgångsrikt behandlats med genterapi med adenoassocierat virus (AAV). I alla tre studierna användes en AAV-vektor för att leverera en funktionell kopia av RPE65-genen, som återställde synen hos barn som lider av LCA. Dessa resultat sågs allmänt som en framgång inom genterapiområdet och har genererat spänning och fart för AAV-medierade tillämpningar vid näthinnesjukdom.
I retinal genterapi är de mest använda vektorerna för okulär genleverans baserade på adenoassocierat virus . Den stora fördelen med att använda adenoassocierat virus för genterapin är att det ger minimala immunsvar och förmedlar långvarigt transgenuttryck i en mängd olika retinala celltyper. Till exempel, täta korsningar som bildar blod-näthinnabarriären, separerar subretinalt utrymme från blodtillförseln, ger skydd mot mikrober och minskar de flesta immunförmedlade skador.
Det saknas fortfarande mycket kunskap när det gäller retinadystrofier. Detaljkarakterisering behövs för att förbättra kunskapen. För att ta itu med denna fråga är skapandet av register ett försök att gruppera och karakterisera sällsynta sjukdomar. Register hjälper till att lokalisera och mäta alla fenotyper av dessa tillstånd och därför tillhandahålla enkla uppföljningar och tillhandahålla en informationskälla till forskarsamhället. Registerdesignen varierar från region till region, men lokalisering och karakterisering av fenotypen är standardguldet. Exempel på register är: RetMxMap . Ett mexikanskt och latinamerikanskt register skapat sedan 2009. Detta register skapades av Dr Adda Lízbeth Villanueva Avilés. Hon är en klinisk forskare som kartlägger ärvda retinadystrofier i Mexiko och andra latinska länder.
Kliniska tester
Lebers medfödda amauros
Prekliniska studier på musmodeller av Lebers medfödda amauros (LCA) publicerades 1996 och en studie på hundar publicerades 2001. 2008 rapporterade tre grupper resultat från kliniska prövningar med adenoassocierat virus för LCA. I dessa studier levererades en AAV-vektor som kodar för RPE65 -genen via en "subretinal injektion", där en liten mängd vätska injiceras under näthinnan i ett kort kirurgiskt ingrepp. Utvecklingen fortsatte och i december 2017 godkände FDA Voretigene neparvovec (Luxturna), en adenoassocierad virusvektorbaserad genterapi för barn och vuxna med bialleliska RPE65-genmutationer ansvariga för retinal dystrofi, inklusive Leber medfödd amauros. Människor måste ha livskraftiga retinala celler som en förutsättning för intraokulär administrering av läkemedlet.
Efter de framgångsrika kliniska prövningarna i LCA har forskare utvecklat liknande behandlingar med adenoassocierat virus för åldersrelaterad makuladegeneration ( AMD). Hittills har ansträngningarna fokuserats på långsiktig leverans av VEGF -hämmare för att behandla den våta formen av makuladegeneration. Medan våt AMD för närvarande behandlas med frekventa injektioner av rekombinant protein i ögongloben, är målet med dessa behandlingar långsiktig sjukdomshantering efter en enda administrering. En sådan studie genomförs vid Lions Eye Institute i Australien i samarbete med Avalanche Biotechnologies, en USA-baserad bioteknikstart-up. En annan studie i ett tidigt skede sponsras av Genzyme Corporation .
Choroideremi
I oktober 2011 tillkännagavs den första kliniska prövningen för behandling av koroidemi . Dr. Robert MacLaren från University of Oxford, som ledde försöket, utvecklade behandlingen tillsammans med Dr. Miguel Seabra från Imperial College, London. Denna fas 1/2-studie använde subretinal AAV för att återställa REP-genen hos drabbade patienter. De första resultaten av studien rapporterades i januari 2014 som lovande eftersom alla sex patienter hade bättre syn.
Färgblindhet
Ny forskning har visat att AAV framgångsrikt kan återställa färgseendet för att behandla färgblindhet hos vuxna apor. Även om denna behandling ännu inte har inletts i kliniska prövningar för människor, ansågs detta arbete vara ett genombrott för förmågan att rikta in sig på konfotoreceptorer.
Mekanism
Fysiologiska komponenter i retinal genterapi
Den neurala näthinnan hos ryggradsdjuren består av flera lager och olika celltyper (se anatomi av den mänskliga näthinnan) . Ett antal av dessa celltyper är inblandade i retinala sjukdomar, inklusive retinala ganglieceller , som degenererar i glaukom, stav- och konfotoreceptorerna , som är känsliga för ljus och degenererar i retinitis pigmentosa , makuladegeneration och andra retinala sjukdomar, och retinala sjukdomar . pigmentepitel (RPE), som stöder fotoreceptorerna och är också inblandat i retinitis pigmentosa och makuladegeneration .
I retinal genterapi är AAV kapabel att "transducera" dessa olika celltyper genom att gå in i cellerna och uttrycka den terapeutiska DNA-sekvensen. Eftersom cellerna i näthinnan inte delar sig, fortsätter AAV att bestå och ge uttryck av den terapeutiska DNA-sekvensen under en lång tidsperiod som kan vara flera år.
AAV-tropism och administreringsvägar
AAV kan transducera flera celltyper i näthinnan. AAV serotyp 2, den mest välstuderade typen av AAV, administreras vanligtvis på en av två vägar: intravitreal eller subretinal. Genom att använda den intravitreala vägen injiceras AAV i ögats glaskropp . Med hjälp av den subretinala vägen injiceras AAV under näthinnan, och drar fördel av det potentiella utrymmet mellan fotoreceptorerna och RPE-skiktet, i ett kort kirurgiskt ingrepp. Även om detta är mer invasivt än den intravitreala vägen, absorberas vätskan av RPE och näthinnan plattar ut på mindre än 14 timmar utan komplikationer. Intravitreal AAV riktar sig mot retinala ganglieceller och några Muller gliaceller. Subretinal AAV riktar sig effektivt mot fotoreceptorer och RPE-celler.
Anledningen till att olika administreringsvägar leder till att olika celltyper transfekteras (t.ex. olika tropism ) är att det inre begränsande membranet (ILM) och de olika retinala lagren fungerar som fysiska barriärer för leverans av läkemedel och vektorer till de djupare retinala lagren . Således totalt sett är subretinal AAV 5-10 gånger effektivare än tillförsel genom att använda intravitreal väg.
Tropismmodifiering och nya AAV-vektorer
En viktig faktor vid genleverans är att utveckla förändrade celltropismer för att minska eller bredda rAAV-medierad genleverans och för att öka dess effektivitet i vävnader. Specifika egenskaper som kapsidkonformation, cellmålstrategier kan avgöra vilka celltyper som påverkas och även effektiviteten av genöverföringsprocessen . Olika typer av modifieringar kan göras. Till exempel modifiering genom kemiska, immunologiska eller genetiska förändringar som gör att AAV2-kapsiden kan interagera med specifika cellytemolekyler .
Inledande studier med AAV i näthinnan har utnyttjat AAV-serotyp 2. Forskare börjar nu utveckla nya varianter av AAV, baserade på naturligt förekommande AAV-serotyper och konstruerade AAV-varianter.
Flera naturligt förekommande serotyper av AAV har isolerats som kan transducera retinala celler. Efter intravitreal injektion kunde endast AAV serotyper 2 och 8 transducera retinala ganglieceller. Enstaka Muller-celler transducerades av AAV-serotyperna 2, 8 och 9. Efter subretinal injektion transducerade serotyperna 2, 5, 7 och 8 effektivt fotoreceptorer och serotyperna 1, 2, 5, 7, 8 och 9 omvandlar effektivt RPE-celler .
Ett exempel på en konstruerad variant har nyligen beskrivits som effektivt transducerar Muller glia efter intravitreal injektion och har använts för att rädda en djurmodell av aggressiv, autosomalt dominant retinitis pigmentosa .
AAV och immunförsvar i näthinnan
Viktigt är att näthinnan är immunprivilegierad och upplever således ingen signifikant inflammation eller immunsvar när AAV injiceras. Immunsvar på genterapivektorer är det som har gjort att tidigare försök till genterapi misslyckats och anses vara en viktig fördel med genterapi i ögat. Återadministrering har varit framgångsrik hos stora djur, vilket tyder på att inget långvarigt immunsvar har uppstått.
Nya data indikerar att den subretinala vägen kan vara föremål för en högre grad av immunprivilegier jämfört med den intravitreala vägen.
Promotorsekvens
Uttryck i olika retinala celltyper kan bestämmas av promotorsekvensen. För att begränsa uttrycket till en specifik celltyp kan en vävnadsspecifik eller celltypsspecifik promotor användas.
Till exempel, hos råttor driver den murina rhodopsingenen uttrycket i AAV2, GFP-reporterprodukt hittades endast i råttfotoreceptorer, inte i någon annan retinal celltyp eller i den intilliggande RPE efter subretinal injektion. Å andra sidan, om omedelbart-tidigt cytomegalovirus (CMV) uttrycks överallt uttrycks förstärkar-promotorn i en mängd olika transfekterade celltyper. Andra allestädes närvarande promotorer såsom CBA-promotorn, en fusion av kyckling-aktin-promotorn och CMV omedelbart-tidig förstärkare, tillåter stabilt GFP-reporteruttryck i både RPE- och fotoreceptorceller efter subretinala injektioner.
Modulering av uttryck
Ibland kan modulering av transgenexpression vara nödvändig eftersom starkt konstitutivt uttryck av en terapeutisk gen i retinala vävnader kan vara skadligt för långvarig retinal funktion. Olika metoder har använts för uttrycksmoduleringen. Ett sätt är att använda exogent reglerbart promotorsystem i AAV-vektorer. Till exempel använder det tetracyklin -inducerbara expressionssystemet en ljuddämpare/transaktivator AAV2-vektor och en separat inducerbar doxycyklin-responsiv saminjektion. När induktion sker av oral doxycyklin visar detta system en tät reglering av genuttryck i både fotoreceptor- och RPE-celler.
Exempel och djurmodeller
Inriktning på RPE
En studie som gjordes av Royal College of Surgeons (RCS) i råttmodell visar att en recessiv mutation i en receptortyrosinkinasgen, mertk resulterar i ett för tidigt stoppkodon och försämrad fagocytosfunktion av RPE-celler. Denna mutation orsakar ackumulering av skräp från yttre segment i det subretinala utrymmet, vilket orsakar fotoreceptorcelldöd . Modellorganismen med denna sjukdom fick en subretinal injektion av AAV-serotyp 2 bärande ett Mertk-cDNA från mus under kontroll av antingen CMV- eller RPE65-promotorerna. Denna behandling visade sig förlänga fotoreceptorcellers överlevnad i flera månader och även antalet fotoreceptorer var 2,5 gånger högre i AAV-Mertk-behandlade ögon jämfört med kontroller 9 veckor efter injektion, även de fann minskad mängd skräp i det subretinala utrymmet.
Proteinet RPE65 används i retinoidcykeln där all-trans-retinolen inom stavens yttre segment isomeriseras till sin 11-cis-form och oxideras till 11-cis-retinal innan den går tillbaka till fotoreceptorn och förenas med opsin-molekylen för att bilda funktionell rhodopsin . I en djur knockout-modell (RPE65-/-) visar genöverföringsexperiment att tidig intraokulär leverans av human RPE65-vektor på embryonal dag 14 visar effektiv transduktion av retinalt pigmentepitel i RPE65-/- knockoutmöss och räddar visuella funktioner. Detta visar att framgångsrik genterapi kan tillskrivas tidig intraokulär leverans till det sjuka djuret.
Inriktning av fotoreceptorer
Juvenil retinoschisis är en sjukdom som påverkar nervvävnaden i ögat. Denna sjukdom är en X-kopplad recessiv degenerativ sjukdom i den centrala gula fläcken och den orsakas av mutation i RSI-genen som kodar för proteinet retinoschisin. Retinoschisin produceras i fotoreceptorn och de bipolära cellerna och det är avgörande för att upprätthålla den synaptiska integriteten hos näthinnan.
Specifikt visade AAV 5-vektorn innehållande vildtyp humant RSI-cDNA som drivs av en mus -opsin-promotor på lång sikt retinal funktionell och strukturell återhämtning. Även näthinnans strukturella tillförlitlighet förbättrades avsevärt efter behandlingen, kännetecknad av en ökning av det yttre kärnskiktets tjocklek.
Retinitis pigmentosa
Retinitis pigmentosa är en ärftlig sjukdom som leder till progressiv nattblindhet och förlust av perifert syn som ett resultat av fotoreceptorcelldöd. De flesta som lider av RP föds med stavceller som antingen är döda eller dysfunktionella, så de är faktiskt blinda på natten, eftersom dessa är cellerna som ansvarar för synen i låga ljusnivåer. Vad som ofta följer är döden av konceller , ansvariga för färgseende och skärpa, vid ljusnivåer som finns under dagen. Förlust av kottar leder till full blindhet redan i femårsåldern, men kanske inte debuterar förrän många år senare. Det har funnits flera hypoteser om hur bristen på stavceller kan leda till att konceller dör. Att fastställa en mekanism för RP är svårt eftersom det finns mer än 39 genetiska loci och gener som är korrelerade med denna sjukdom. I ett försök att hitta orsaken till RP har det funnits olika genterapitekniker för att ta itu med var och en av hypoteserna.
Olika typer av arv kan tillskriva denna sjukdom; autosomal recessiv, autosomal dominant, X-länkad typ, etc. Rhodopsinets huvudfunktion är att initiera fototransduktionskaskaden . Opsinproteinerna görs i fotoreceptorns inre segment, transporteras sedan till det yttre segmentet och fagocyteras så småningom av RPE-cellerna. När mutationer inträffar i rhodopsinet påverkas den riktade proteinrörelsen eftersom mutationerna kan påverka proteinveckning , stabilitet och intracellulär trafik. Ett tillvägagångssätt är att introducera AAV-levererade ribozymer utformade för att rikta och förstöra ett muterat mRNA.
Hur detta system fungerar visades i djurmodeller som har en mutant rhodopsingenen. De injicerade AAV-ribozymerna optimerades in vitro och användes för att klyva det muterade mRNA-transkriptet av P23H (där de flesta mutationer förekommer) in vivo.
En annan mutation i rhodopsin-strukturproteinet, specifikt periferin 2 som är ett membranglykoprotein som är involverat i bildandet av fotoreceptorns yttre segmentskiva, kan leda till recessiv RP och makuladegeneration hos människa (19). I ett musexperiment levererades AAV2 bärande en periferin 2-gen av vildtyp driven av en rhodopsin-promotor till mössen genom subretinal injektion. Resultatet visade förbättring i fotoreceptorstruktur och funktion som detekterades av ERG (elektroretinogram). Resultatet visade förbättring av fotoreceptorstruktur och funktion som detekterades av ERG. Även periferin 2 detekterades vid det yttre segmentlagret av näthinnan 2 veckor efter injektion och terapeutiska effekter noterades så snart som 3 veckor efter injektion. Ett väldefinierat yttre segment som innehöll både periferin2 och rhodopsin var närvarande 9 månader efter injektionen.
Eftersom apoptos kan vara orsaken till fotoreceptordöd i de flesta retinala dystrofier. Det har varit känt att överlevnadsfaktorer och antiapoptoiska reagens kan vara en alternativ behandling om mutationen är okänd för genersättningsterapi. Vissa forskare har experimenterat med att behandla detta problem genom att injicera ersättande trofiska faktorer i ögat. En grupp forskare injicerade det stavhärledda konviabilitetsfaktorn (RdCVF) proteinet (kodat av Nxnl1 (Txnl6)-genen) i ögat på de vanligast förekommande dominerande RP-mutationsråttmodellerna. Denna behandling visade framgång för att främja överlevnaden av konaktivitet, men behandlingen tjänade ännu mer till att förhindra utvecklingen av sjukdomen genom att öka konernas faktiska funktion. Experiment utfördes också för att studera om tillförsel av AAV2-vektorer med cDNA för gliacellinjehärledd neurotrofisk faktor (GDNF) kan ha en anti-apoptoseffekt på stavcellerna . När man tittar på en djurmodell innehåller opsintransgenen ett trunkerat protein som saknar de sista 15 aminosyrorna i C-terminalen, vilket orsakar förändringar i rhodopsintransporten till det yttre segmentet och leder till retinal degeneration. När AAV2-CBA-GDNF-vektorn administreras till det subretinala utrymmet stabiliserades fotoreceptorn och stavfotoreceptorerna ökade och detta sågs i den förbättrade funktionen av ERG-analysen. Framgångsrika djurförsök har också utförts med ciliär neurotrofisk faktor (CNTF), och CNTF används för närvarande som behandling i kliniska prövningar på människor.
AAV-baserad behandling för retinala neovaskulära sjukdomar
Okulär neovaskularisering (NV) är onormal bildning av nya kapillärer från redan existerande blodkärl i ögat, och detta är en egenskap för ögonsjukdomar som diabetisk retinopati (DR), retinopati av prematuritet (ROP) och (våt form) ålder- relaterad makuladegeneration (AMD). En av huvudaktörerna i dessa sjukdomar är VEGF (Vascular endothelial growth factor) som är känd för att inducera kärlläckage och som också är känd för att vara angiogen. I normala vävnader stimulerar VEGF endotelcellsproliferation på ett dosberoende sätt, men sådan aktivitet går förlorad med andra angiogena faktorer.
Många angiostatiska faktorer har visat sig motverka effekten av att öka lokal VEGF. Den naturligt förekommande formen av löslig Flt-1 har visats motverka neovaskularisering hos råttor, möss och apor.
Pigmentepitelhärledd faktor ( PEDF ) fungerar också som en hämmare av angiogenes . Utsöndringen av PEDF minskar märkbart under hypoxiska förhållanden, vilket tillåter den endotelial mitogena aktiviteten av VEGF att dominera, vilket tyder på att förlusten av PEDF spelar en central roll i utvecklingen av ischemi -driven NV. Ett kliniskt fynd visar att nivåerna av PEDF i kammarvatten hos människor minskar med stigande ålder, vilket indikerar att minskningen kan leda till utveckling av AMD. I en djurmodell förhindrade en AAV med humant PEDF-cDNA under kontroll av CMV-promotorn koroidal och retinal NV (24).
Fyndet tyder på att det AAV-medierade uttrycket av angiostatiska faktorer kan implementeras för att behandla NV. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart som ett alternativ till frekventa injektioner av rekombinant protein i ögat. Dessutom kan PEDF och sFlt-1 kunna diffundera genom skleravävnad , vilket möjliggör att potentialen är relativt oberoende av det intraokulära administreringsstället.