Enkelkedjigt variabelt fragment

Roterande scFv-fragment med markerade komplementaritetsbestämmande regioner (CDR)

De två möjliga strukturerna av ett enkelkedjigt variabelt fragment, med antigenbindningsställena inklusive N-terminalerna till vänster och C-terminalerna till höger. Linkerpeptiderna visas som pilar.

Ett enkelkedjigt variabelt fragment ( scFv ) är egentligen inte ett fragment av en antikropp, utan är istället ett _{fusionsprotein} av de variabla regionerna av de tunga (VH ₎ och lätta kedjorna (VL ) av immunglobuliner , kopplade till en kort länkare peptid med tio till cirka 25 aminosyror . Linkern är vanligtvis rik på glycin för flexibilitet, såväl som serin eller treonin för löslighet, och kan antingen koppla N-terminalen av VH _med C -terminalen av VL _, eller vice versa . Detta protein behåller specificiteten hos det ursprungliga immunglobulinet, trots avlägsnande av de konstanta regionerna och införandet av länken. Bilden till höger visar hur denna modifiering vanligtvis lämnar specificiteten oförändrad.

Dessa molekyler skapades för att underlätta fagvisning , där det är mycket bekvämt att uttrycka den antigenbindande domänen som en enda peptid. Som ett alternativ kan scFv skapas direkt från subklonade tunga och lätta kedjor härledda från ett hybridom . ScFvs har många användningsområden, t.ex. flödescytometri , immunhistokemi och som antigenbindande domäner av artificiella T-cellsreceptorer (chimär antigenreceptor).

Till skillnad från monoklonala antikroppar , som ofta produceras i däggdjurscellkulturer, produceras scFv oftare i bakteriecellskulturer såsom E. coli .

Rening

Enkelkedjiga variabla fragment saknar den konstanta Fc-regionen som finns i kompletta antikroppsmolekyler, och därför kan de vanliga bindningsställena (t.ex. protein G ) inte användas för att rena antikroppar. Dessa fragment kan ofta renas eller immobiliseras med användning av protein L , eftersom protein L interagerar med den variabla regionen av lätta kappa-kedjor. Mer vanligt är att forskare införlivar en sex histidintagg på c-terminalen av scFv-molekylen och renar dem med immobiliserad metallaffinitetskromatografi (IMAC). Vissa scFv kan också fångas upp av protein A om de innehåller en human VH3-domän.

Bivalenta och trivalenta scFvs

Struktur av tvåvärda (överst) och trevärda (botten) scFvs, tandem (vänster) och di-/trimeriseringsformat (höger)

Divalenta (eller bivalenta ) enkelkedjiga variabla fragment (di-scFvs, bi-scFvs) kan konstrueras genom att länka två scFvs. Detta kan göras genom att producera en enda peptidkedja med två VH- _och två VL- _regioner , vilket ger tandem scFvs . En annan möjlighet är skapandet av scFv med länkpeptider som är för korta för att de två variabla regionerna ska vikas ihop (cirka fem aminosyror), vilket tvingar scFv att dimerisera. Denna typ är känd som diabodies . Diakroppar har visat sig ha dissociationskonstanter upp till 40 gånger lägre än motsvarande scFv, vilket betyder att de har en mycket högre affinitet till sitt mål. Följaktligen kan diakroppsläkemedel doseras mycket lägre än andra terapeutiska antikroppar och är kapabla att mycket specifik inriktning av tumörer in vivo. Ännu kortare länkar (en eller två aminosyror) leder till bildandet av trimerer, så kallade triabodies eller tribodies . Tetrakroppar har också producerats. De uppvisar en ännu högre affinitet till sina mål än diakroppar.

Alla dessa format kan vara sammansatta av variabla fragment med specificitet för två olika antigener, i vilket fall de är typer av bispecifika antikroppar . De längst utvecklade av dessa är bispecifika tandem di-scFvs, kända som bispecifika T-cells engagerare ( BiTE-antikroppskonstruktioner).

Exempel

• Pexelizumab , ett scFv som binder till komponent 5 i komplementsystemet och utformat för att minska biverkningar av hjärtkirurgi
• C6.5, en diakropp riktad mot HER2/neu som finns i vissa bröstcancerformer
• Brolucizumab , en scFV som binder till VEGF-A och används för att behandla våt åldersrelaterad makuladegeneration