DARPin

DARPins (en akronym för designade repeterande ankyrinproteiner ) är genetiskt modifierade antikroppsmimetiska proteiner som vanligtvis uppvisar mycket specifik och högaffinitetsmålproteinbindning . De härrör från naturliga ankyrinproteiner , en av de vanligaste klasserna av bindande proteiner i naturen, som är ansvariga för olika funktioner såsom cellsignalering, reglering och strukturell integritet av cellen. DARPins består av minst tre, upprepade motiv eller moduler, av vilka de mest N- och de mest C-terminala modulerna kallas "caps", eftersom de skyddar proteinets hydrofoba kärna. Antalet interna moduler anges som antal (t.ex. N1C, N2C, N3C, ...) medan locken indikeras med "N" respektive "C". Molekylmassan på t.ex. 14 eller 18 kDa ( kilodalton ) för fyra (N2C) eller fem (N3C) upprepade DARPiner är ganska liten för en biologisk substans (ca 10 % av storleken på en IgG ) .

DARPins utgör en ny klass av potenta, specifika och mångsidiga småproteinterapier och används som undersökningsverktyg i olika forsknings-, diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Molecular Partners AG , ett biofarmaceutiskt företag i klinisk fas med flera DARPin-molekyler i klinisk och preklinisk utveckling, driver för närvarande den egna utvecklingen av terapeutiska DARPins ( framåtintegrering) . Athebio AG bygger på att ytterligare förbättra DARPin-ställningen för en partnermodell .

Dessutom kan DARPins användas som kristallisationsledare för lösliga proteiner och membranproteiner, inklusive G-proteinkopplade receptorer (GPCR), antingen som bindningspartner eller som stela fusioner till målproteinet.

Ursprung, struktur och generation

En DARPin med fem ankyrin-repeterande motiv (​)

Andreas Plückthuns laboratorium vid universitetet i Zürich, Schweiz , samtidigt som man studerade teknik och bibliotek av rekombinanta antikroppar. DARPins är härledda från naturligt förekommande ankyrinproteiner, en proteinklass som förmedlar högaffinitetsprotein- proteininteraktioner i naturen.

DARPin-bibliotek designades via sekvensanpassningar av flera tusen naturliga ankyrinupprepningsmotiv (om cirka 33 aminosyror vardera) kombinerat med strukturbaserad design och rekombinanta DNA- metoder. Dessa proteiner består av repetitiva strukturella enheter som bildar en stabil proteindomän med en stor potentiell målinteraktionsyta. Vanligtvis innefattar DARPins fyra eller fem upprepningar, av vilka den första (N-capping repeat) och sista (C-capping repeat) tjänar till att skydda den hydrofoba proteinkärnan från den vattenhaltiga miljön. DARPins motsvarar den genomsnittliga storleken på naturliga ankyrin-repeterande proteindomäner. Proteiner med färre än tre upprepningar (dvs. de täckande upprepningarna och en intern upprepning) bildar inte en tillräckligt stabil tertiär struktur. Molekylmassan för en DARPin beror på det totala antalet upprepningar, som visas i följande diagram:

Upprepas	3	4	5	6	7	...
Ungefärlig massa (kDa)	10	14	18	22	26	...

Bibliotek av DARPins med randomiserade potentiella målinteraktionsrester, med diversiteter på över 10 ¹² varianter, har genererats på DNA-nivå. Från dessa bibliotek kan biokemister välja DARPins för att binda det valda målet med pikomolär affinitet och specificitet kan väljas med användning av ribosomvisning eller fagvisning med användning av signalsekvenser som tillåter kotranslationell utsöndring. DARPins kan utformas för att fungera som receptoragonister , antagonister , omvända agonister , enzyminhibitorer eller enkla målproteinbindare.

Egenskaper och potentiella fördelar med DARPins

DARPiner uttrycks i cytoplasman hos Escherichia coli i höga nivåer (över 10 g/L i fermentering, 1 g/L i skakkolv) i löslig form. Proteinerna uppvisar hög termisk och termodynamisk stabilitet ( denatureringsmittpunkt : vanligtvis jämviktsutveckling : ∆G > 9,5 kcal/mol ) som ökar med ökande upprepningsantal. DARPins är stabila i humant blodserum och kan konstrueras så att de inte innehåller T- cellsepitoper .

På grund av den höga specificiteten, stabiliteten, styrkan och affiniteten, såväl som deras flexibla arkitektur, har DARPins ett styvt kroppsbindande läge. Multispecifika eller multivalenta konstruktioner gjorda genom genetisk fusion tyder på att fusionerade DARPiner har liknande bindningsegenskaper som DARPiner med en enda domän. Frånvaron av cysteiner i ställningen möjliggör konstruktion av platsspecifika cysteiner, vilket möjliggör platsriktad koppling av kemikalier till molekylen. Icke-naturliga aminosyror kan införas för samma ändamål.

Potentiellt kan DARPins ge kliniska fördelar genom att övervinna begränsningarna hos konventionella terapeutiska tillvägagångssätt, som vanligtvis riktar sig mot en enskild sjukdomsväg och därmed kan äventyra effekten. I många fall är komplexiteten hos en sjukdom ett resultat av dysregleringen av flera vägar. DARPin-teknologi kan utnyttjas för att snabbt generera tusentals olika "multi-DARPins" där de bindande domänerna är sammankopplade (dvs genom länkar), vilket möjliggör målinriktning av flera sjukdomsvägar. DARPins och multi-DARPins kan också fusioneras till icke-DARPin-element, såsom ett toxin, för att generera målinriktade terapier, och deras tillverkning underlättas av DARPins motstånd mot aggregering. Mångfalden av format och robusthet hos multi-DARPins underlättar ett empiriskt tillvägagångssätt (som genom resultatbaserad screening) för att effektivt identifiera DARPins med potentiell aktivitet i specifika sjukdomsvägar.

De potentiella fördelarna med DARPins beror till stor del på deras strukturella och biofysiska egenskaper. Deras ringa storlek (14-18 kDa) tros möjliggöra ökad vävnadspenetration, och deras höga styrka (<5-100 pM) gör DARPins aktiva i låga koncentrationer. DARPins är lösliga vid >100 g/L, och deras höga stabilitet och löslighet anses vara önskvärda egenskaper för läkemedelsföreningar. DARPins kan produceras snabbt och kostnadseffektivt (dvs från E. coli ). Deras farmakokinetiska (PK) egenskaper kan justeras genom fusion till halveringstidsförlängande molekyler, såsom polyetylenglykol (PEG), eller till DARPins som binder till humant serumalbumin. På grund av deras gynnsamma biofysiska egenskaper anses DARPins vara mycket utvecklingsbara med standardprocesser, vilket potentiellt uppvisar robust klassbeteende.

Klinisk utveckling och applikationer

DARPins har använts som forskningsverktyg, som diagnostiska medel och som terapeutiska medel. MP0112, den första DARPin-kandidaten på kliniken, är en av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) och gick in i kliniska prövningar för behandling av våt åldersrelaterad makuladegeneration (våt AMD, även känd som neovaskulär åldersrelaterad makuladegeneration) och diabetiker makulaödem i början av 2010.

För närvarande undersöks MP0112 i tre olika kliniska prövningar. De två första studierna är säkerhets- och effektstudier av abicipar hos patienter med våt AMD för att fastställa jämförbarhet mellan japanska och icke-japanska patienter. Den tredje studien ska testa säkerheten och effekten av abicipar hos patienter med DME.

I juli 2014 inledde Molecular Partners en första-in-human-studie för att undersöka säkerheten, tolerabiliteten och blodnivåerna för MP0250, en andra DARPin-kandidat, hos patienter med cancer.

Molecular Partners AG har flera ytterligare DARPins i preklinisk utveckling med potentiella indikationer inom olika sjukdomsområden, inklusive oftalmologi , onkologi , immunonkologi och immunologi .