DNA-blandning

Punktmutationer resulterar i enstaka nukleotidförändringar medan insättningar och deletioner resulterar i tillägg eller avlägsnande av nukleotider. DNA-shuffling möjliggör rekombination av modergener vilket dramatiskt ökar hastigheten för riktad evolution. DNA-shuffling är användbar för att generera proteiner med nya egenskaper eller kombinationer av önskade egenskaper.

DNA-shuffling , även känd som molekylär förädling, är en slumpmässig rekombinationsmetod in vitro för att generera muterade gener för riktad evolution och för att möjliggöra en snabb ökning av DNA -bibliotekets storlek. Tre procedurer för att åstadkomma DNA-shuffling är molekylär förädling som bygger på homolog rekombination eller likheten mellan DNA-sekvenserna, restriktionsenzymer som förlitar sig på vanliga restriktionsställen och icke-homolog slumpmässig rekombination som kräver användning av hårnålar . I alla dessa tekniker fragmenteras modergenerna och rekombineras sedan.

DNA-shuffling använder slumpmässig rekombination i motsats till platsriktad mutagenes för att generera proteiner med unika attribut eller kombinationer av önskvärda egenskaper som kodas i modergenerna såsom termostabilitet och hög aktivitet. Potentialen för DNA-shuffling att producera nya proteiner exemplifieras av figuren som visas till höger som visar skillnaden mellan punktmutationer, insertioner och deletioner och DNA-shuffling. Specifikt visar denna figur användningen av DNA-shuffling på två modergener, vilket möjliggör generering av rekombinanta proteiner som har en slumpmässig kombination av sekvenser från varje föräldergen. Detta skiljer sig från punktmutationer där en nukleotid har ändrats, infogats eller tagits bort och insättningar eller deletioner där en sekvens av nukleotider har lagts till respektive tagits bort. Som ett resultat av den slumpmässiga rekombinationen kan DNA-shuffling producera proteiner med nya kvaliteter eller flera fördelaktiga egenskaper som härrör från modergenerna.

1994 publicerade Willem PC Stemmer den första artikeln om DNA-blandning. Sedan introduktionen av tekniken har DNA-shuffling tillämpats på protein- och småmolekylära läkemedel, bioremediering , vacciner , genterapi och utvecklade virus. Andra tekniker som ger liknande resultat som DNA-shuffling inkluderar slumpmässig chimeragenes på transienta mallar (RACHITT), slumpmässig utskrift in vitro-rekombination (RPR) och stegrad förlängningsprocessen (StEP).

Historia

DNA-blandning genom molekylär avel rapporterades första gången 1994 av Willem PC Stemmer. Han började med att fragmentera β-laktamasgenen som hade amplifierats med polymeraskedjereaktionen (PCR) genom att använda DNas I , som slumpmässigt klyver DNA. Han fullbordade sedan en modifierad PCR-reaktion där primrar inte användes, vilket resulterade i hybridisering av homologa fragment eller fragment med liknande sekvenser. Slutligen amplifierades dessa fragment med PCR. Stemmer rapporterade att användningen av DNA-shuffling i kombination med backcrossing resulterade i eliminering av icke-essentiella mutationer och en ökning av produktionen av antibiotikumet cefotaxim . Han betonade också potentialen för molekylär evolution med DNA-shuffling. Specifikt angav han att tekniken kan användas för att modifiera proteiner.

DNA-shuffling har sedan dess använts för att generera bibliotek av hybrid- eller chimära gener och har inspirerat familjeshuffling som definieras som användningen av relaterade gener i DNA-shuffling. Dessutom har DNA-shuffling tillämpats på protein- och småmolekylära läkemedel, bioremediering, genterapi, vacciner och utvecklade virus.

Förfaranden

Molekylär avel

Först används DNas I för att fragmentera en uppsättning av föräldergener till segment av dubbelsträngat DNA som sträcker sig från 10-50 bp till mer än 1 kbp. Detta följs av en PCR utan primers. I PCR kommer DNA-fragment med tillräckligt överlappande sekvenser att hybridisera till varandra och sedan förlängas med DNA-polymeras . PCR-förlängningen kommer inte att ske om det inte finns DNA-sekvenser med hög likhet. De viktiga faktorerna som påverkar sekvenserna som syntetiseras i DNA-shuffling är DNA-polymeraset, saltkoncentrationerna och hybridiseringstemperaturen. Till exempel resulterar användningen av Taq-polymeras för amplifiering av ett 1 kbp-fragment i en PCR på 20 cykler i att 33 % till 98 % av produkterna innehåller en eller flera mutationer.

Flera cykler av PCR-förlängning kan användas för att amplifiera fragmenten. Tillägget av primrar som är utformade för att vara komplementära till ändarna av de förlängda fragmenten tillsätts för att ytterligare amplifiera sekvenserna med en annan PCR. Primers kan väljas så att ytterligare sekvenser adderas till sina 5'-ändar, såsom sekvenser för igenkänningsställen för restriktionsenzym som behövs för ligering in i en kloningsvektor .

Det är möjligt att rekombinera delar av föräldragenerna för att generera hybrider eller chimära former med unika egenskaper, därav termen DNA-shuffling. Nackdelen med molekylär förädling är kravet på likheten mellan sekvenserna, vilket har inspirerat till utvecklingen av andra procedurer för DNA-shuffling.

Restriktionsenzymer

Restriktionsenzymer används för att fragmentera modergenerna. Fragmenten sammanfogas sedan genom ligering som kan åstadkommas med DNA-ligas . Till exempel, om två föräldergener har tre restriktionsställen kan fjorton olika fullängdsgenhybrider skapas. Antalet unika fullängdshybrider bestäms av det faktum att en gen med tre restriktionsställen kan delas upp i fyra fragment . Således finns det två alternativ för var och en av de fyra positionerna minus de kombinationer som skulle återskapa de två föräldergenerna vilket ger 2 4 - 2 = 14 olika fullängdshybridgener .

Huvudskillnaden mellan DNA-shuffling med restriktionsenzymer och molekylär förädling är molekylär förädling beroende på homologin hos sekvenserna för hybridisering av strängarna och PCR för förlängning, medan genom att använda restriktionsenzymer skapas fragmentändar som kan ligeras. De främsta fördelarna med att använda restriktionsenzymer inkluderar kontroll över antalet rekombinationshändelser och avsaknad av PCR-amplifieringskrav. Den största nackdelen är kravet på vanliga restriktionsenzymställen.

Icke-homolog slumpmässig rekombination

För att generera segment som sträcker sig från 10-50 bp till mer än 1 kb, används DNas I. Ändarna av fragmenten görs trubbiga genom att tillsätta T4 DNA-polymeras. Att göra fragmenten trubbiga är viktigt för att kombinera fragmenten eftersom inkompatibla klibbiga ändar , eller överhäng, förhindrar sammanfogning av ändarna. Hårnålar med ett specifikt restriktionsställe läggs sedan till blandningen av fragment. Därefter används T4 DNA-ligas för att ligera fragmenten för att bilda utökade sekvenser. Ligeringen av hårnålarna till fragmenten begränsar längden på de utökade sekvenserna genom att förhindra tillägg av fler fragment. Slutligen, för att ta bort hårnålsöglorna, används ett restriktionsenzym.

Icke-homolog slumpmässig rekombination skiljer sig från molekylär förädling eftersom homologi av de ligerade sekvenserna inte är nödvändig, vilket är en fördel. Eftersom denna process rekombinerar fragmenten slumpmässigt är det emellertid troligt att en stor del av de rekombinerade DNA-sekvenserna inte kommer att ha de önskade egenskaperna, vilket är en nackdel . Icke-homolog slumpmässig rekombination skiljer sig också från användningen av restriktionsenzymer för DNA-shuffling eftersom vanliga restriktionsenzymställen på modergenerna inte krävs och användningen av hårnålar är nödvändig vilket visar en fördel och nackdel med icke-homolog slumpmässig rekombination framför användningen av restriktionsenzymer, respektive.

Ansökningar

Protein och småmolekylära läkemedel

Eftersom DNA-shuffling möjliggör rekombination av gener, kan proteinaktiviteter förbättras. Till exempel har DNA-shuffling använts för att öka styrkan hos faguppvisade rekombinanta interferoner på murina och mänskliga celler. Dessutom åstadkoms förbättringen av grönt fluorescerande protein (GFP) med DNA-shuffling genom molekylär förädling som en 45 gånger högre signal än standarden för helcellsfluorescens erhölls. Dessutom kan syntesen av olika gener också resultera i produktion av proteiner med nya egenskaper. Därför har DNA-shuffling använts för att utveckla proteiner för att avgifta kemikalier. Till exempel har den homologa rekombinationsmetoden för DNA-blandning genom molekylär förädling använts för att förbättra avgiftningen av atrazin och arsenat .

Bioremediering

DNA-shuffling har också använts för att förbättra nedbrytningen av biologiska föroreningar. Specifikt har en rekombinant E. coli-stam skapats med användning av DNA-shuffling genom molekylär förädling för bioremediering av trikloretylen (TCE), ett potentiellt cancerframkallande ämne , som är mindre mottagligt för toxiska epoxidintermediärer.

Vacciner

Förmågan att välja önskvärda rekombinanter med DNA-shuffling har använts i kombination med screeningstrategier för att förbättra vaccinkandidater mot infektioner med tonvikt på att förbättra immunogenicitet , vaccinproduktion, stabilitet och korsreaktivitet mot flera stammar av patogener. Vissa vaccinkandidater för Plasmodium falciparum , denguevirus , encefalitiska alfavirus (inklusive: VEEV , WEEV och EEEV ), humant immunbristvirus-1 (HIV-1) och hepatit B-virus (HBV) har undersökts.

Genterapi och utvecklade virus

Kraven för human genterapi inkluderar hög renhet, hög titer och stabilitet. DNA-blandning möjliggör tillverkning av retrovirala vektorer med dessa attribut. Till exempel användes DNA-shuffling med molekylär förädling på sex ekotropiska murina leukemivirus (MLV) stammar vilket resulterade i sammanställningen av ett omfattande bibliotek av rekombinant retrovirus och identifieringen av multipla kloner med ökad stabilitet. Vidare användes tillämpningen av DNA-shuffling genom molekylär förädling på multipla förälder -adenoassocierade virusvektorer ( AAV) för att generera ett bibliotek av tio miljoner chimärer. De fördelaktiga egenskaperna som erhålls inkluderar ökad resistens mot humant intravenöst immunglobulin (IVIG) och produktionen av celltropism i de nya virusen.

Jämförelse med andra tekniker

Medan DNA-shuffling har blivit en användbar teknik för slumpmässig rekombination, har andra metoder inklusive RACHITT, RPR och StEP också utvecklats för detta ändamål. Nedan följer några fördelar och nackdelar med dessa andra metoder för rekombination.

RACHITT

I RACHITT hybridiseras fragment av enkelsträngade (ss) föräldergener till en ss-mall vilket resulterar i minskad felmatchning, vilket är en fördel. Dessutom möjliggör RACHIIT att gener med låg sekvenslikhet kan rekombineras. En stor nackdel är emellertid framställningen av ss-fragmenten av modergenerna och ss-mallen.

RPR

RPR använder sig av slumpmässiga primers. Dessa slumpmässiga primrar hybridiseras till mall-DNA och förlängs sedan av Klenow-fragmentet . Därefter avlägsnas mallarna och fragmenten sätts samman genom homologi i en process liknande PCR. Några stora fördelar inkluderar det mindre kravet på föräldragener på grund av användningen av ss-mallar och ökad sekvensdiversitet genom felpriming och felinkorporering. En nackdel med RPR är utarbetandet av mallen.

Steg

I StEP används korta cykler av primer-annealing till en mall och förlängning med polymeras för att generera fullängdssekvenser. De främsta fördelarna med StEP är metodens enkelhet och bristen på fragmentrening. Nackdelarna med StEP inkluderar att det är tidskrävande och kräver sekvenshomologi.

Se även

  1. ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s t u v w x y z aa ab ac ad ae af ag ah ai    Glick BR ​​(2017). Molekylär bioteknik: principer och tillämpningar av rekombinant DNA . Cheryl L. Patten (femte upplagan). Washington, DC. ISBN 978-1-55581-936-1 . OCLC 975991667 .
  2. ^ a b    Levi T, Sloutskin A, Kalifa R, Juven-Gershon T, Gerlitz O (2020-07-14). "Effektiv in vivo-introduktion av punktmutationer med ssODN och en Co-CRISPR-metod" . Biologiska procedurer online . 22 (1): 14. doi : 10.1186/s12575-020-00123-7 . PMC 7362497 . PMID 32684853 .
  3. ^ a b c d e f g h i   Patten PA, Howard RJ, Stemmer WP (december 1997). "Tillämpningar av DNA-shuffling på läkemedel och vacciner". Aktuell åsikt inom bioteknik . 8 (6): 724–733. doi : 10.1016/S0958-1669(97)80127-9 . PMID 9425664 .
  4. ^ a b c d e f g h i j   Cirino PC, Qian S (2013-01-01), Zhao H (red.), "Kapitel 2 - Protein Engineering as an Enabling Tool for Synthetic Biology", Synthetic Biology , Boston : Academic Press, s. 23–42, doi : 10.1016/b978-0-12-394430-6.00002-9 , ISBN 978-0-12-394430-6
  5. ^ a b c   Clark DP, Pazdernik NJ (2016), "Protein Engineering", Biotechnology , Elsevier, s. 365–392, doi : 10.1016/b978-0-12-385015-7.00011-9 , ISBN 9278-0 -385015-7
  6. ^   Kamada H (2013-01-01), Park K, Tsunoda SI (red.), "5 - Generera funktionella mutanta proteiner för att skapa mycket bioaktiva anticancerbiopharmaceuticals", Biomaterials for Cancer Therapeutics , Woodhead Publishing, s. 95–112, doi : 10.1533/9780857096760.2.95 , ISBN 978-0-85709-664-7
  7. ^ a b c d e f g h i j k l    Biobearbetning för förädlade produkter från förnybara resurser: nya teknologier och applikationer . Shang-Tian Yang (första upplagan). Amsterdam: Elsevier. 2007. ISBN 978-0-444-52114-9 . OCLC 162587118 . {{ citera bok }} : CS1 underhåll: andra ( länk )
  8. ^ a b   Arkin M (2001-01-01), "In vitro Mutagenese", i Brenner S, Miller JH (red.), Encyclopedia of Genetics , New York: Academic Press, s. 1010–1014, doi : 10.1006/ rwgn.2001.0714 , ISBN 978-0-12-227080-2
  9. ^   Marshall SH (november 2002). "DNA-blandning: inducerad molekylär förädling för att producera en ny generation långvariga vacciner". Bioteknologiska framsteg . 20 (3–4): 229–238. doi : 10.1016/s0734-9750(02)00015-0 . PMID 14550030 .
  10. ^ a b c d e   Locher CP, Paidhungat M, Whalen RG, Punnonen J (april 2005). "DNA-blandning och screeningstrategier för att förbättra vaccinets effektivitet". DNA och cellbiologi . 24 (4): 256–263. doi : 10.1089/dna.2005.24.256 . PMID 15812242 .
  11. ^ a b c d e    Powell SK, Kaloss MA, Pinkstaff A, McKee R, Burimski I, Pensiero M, et al. (december 2000). "Avel av retrovirus genom DNA-shuffling för förbättrad stabilitet och bearbetningsutbyten". Natur Bioteknik . 18 (12): 1279–1282. doi : 10.1038/82391 . PMID 11101807 . S2CID 1865270 .
  12. ^ a b c d   Rui L, Kwon YM, Reardon KF, Wood TK (maj 2004). "Metabolisk vägteknik för att förbättra aerob nedbrytning av klorerade etener och minska deras toxicitet genom att klona ett nytt glutation S-transferas, ett utvecklat toluen-o-monooxygenas och gamma-glutamylcysteinsyntetas". Miljömikrobiologi . 6 (5): 491–500. doi : 10.1111/j.1462-2920.2004.00586.x . PMID 15049922 .
  13. ^ a b c d e f g   Kurtzman AL, Govindarajan S, Vahle K, Jones JT, Heinrichs V, Patten PA (augusti 2001). "Framsteg i riktad proteinevolution genom rekursiv genetisk rekombination: tillämpningar på terapeutiska proteiner". Aktuell åsikt inom bioteknik . 12 (4): 361–370. doi : 10.1016/S0958-1669(00)00228-7 . PMID 11551464 .
  14. ^ a b c d e f g h i    Stemmer WP (augusti 1994). "Snabb utveckling av ett protein in vitro genom DNA-blandning". Naturen . 370 (6488): 389–391. Bibcode : 1994Natur.370..389S . doi : 10.1038/370389a0 . PMID 8047147 . S2CID 4363498 .
  15. ^ "DNase I (RNase-fri) | NEB" . www.neb.com . Hämtad 2021-10-30 .
  16. ^ a b c d e f    Stemmer WP (oktober 1994). "DNA-blandning genom slumpmässig fragmentering och återmontering: in vitro-rekombination för molekylär evolution" . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 91 (22): 10747–10751. Bibcode : 1994PNAS...9110747S . doi : 10.1073/pnas.91.22.10747 . PMC 45099 . PMID 7938023 .
  17. ^    Kikuchi M, Ohnishi K, Harayama S (2000-02-08). "En effektiv familjeblandningsmetod som använder enkelsträngat DNA". Gene . 243 (1): 133–137. doi : 10.1016/S0378-1119(99)00547-8 . ISSN 0378-1119 . PMID 10675621 .
  18. ^    Crameri A, Raillard SA, Bermudez E, Stemmer WP (januari 1998). "DNA-blandning av en familj av gener från olika arter påskyndar riktad evolution". Naturen . 391 (6664): 288–291. Bibcode : 1998Natur.391..288C . doi : 10.1038/34663 . PMID 9440693 . S2CID 4352696 .
  19. ^    Coco WM, Levinson WE, Crist MJ, Hektor HJ, Darzins A, Pienkos PT, et al. (april 2001). "DNA-blandningsmetod för att generera starkt rekombinerade gener och utvecklade enzymer". Natur Bioteknik . 19 (4): 354–359. doi : 10.1038/86744 . PMID 11283594 . S2CID 35360374 .
  20. ^ a b c    Crameri A, Whitehorn EA, Tate E, Stemmer WP (mars 1996). "Förbättrat grönt fluorescerande protein genom molekylär evolution med hjälp av DNA-shuffling". Natur Bioteknik . 14 (3): 315–319. doi : 10.1038/nbt0396-315 . PMID 9630892 . S2CID 22803570 .
  21. ^ a b c d e f    Zhao H, Arnold FH (mars 1997). "Optimering av DNA-shuffling för högtrohetsrekombination" . Nukleinsyraforskning . 25 (6): 1307–1308. doi : 10.1093/nar/25.6.1307 . PMC 146579 . PMID 9092645 .
  22. ^    Bacher JM, Reiss BD, Ellington AD (juli 2002). "Förutseende evolution och DNA-blandning" . Genombiologi . 3 (8): REVIEWS1021. doi : 10.1186/gb-2002-3-8-reviews1021 . PMC 139397 . PMID 12186650 .
  23. ^    Engler C, Gruetzner R, Kandzia R, Marillonnet S (2009-05-14). "Golden gate shuffling: en DNA-shuffling-metod i en pott baserad på typ IIs restriktionsenzymer" . PLOS ETT . 4 (5): e5553. Bibcode : 2009PLoSO...4.5553E . doi : 10.1371/journal.pone.0005553 . PMC 2677662 . PMID 19436741 .
  24. ^ a b c d e    Bittker JA, Le BV, Liu JM, Liu DR (maj 2004). "Riktad utveckling av proteinenzymer med användning av icke-homolog slumpmässig rekombination" . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 101 (18): 7011–7016. Bibcode : 2004PNAS..101.7011B . doi : 10.1073/pnas.0402202101 . PMC 406457 . PMID 15118093 .
  25. ^    Zhu S, Peng A (juni 2016). "Icke-homolog ändfogningsreparation i Xenopus äggextrakt" . Vetenskapliga rapporter . 6 (1): 27797. Bibcode : 2016NatSR...627797Z . doi : 10.1038/srep27797 . PMC 4914968 . PMID 27324260 .
  26. ^    Ogiwara H, Kohno T (2011-12-14). "Väsentliga faktorer för inkompatibel DNA-ändesammanfogning vid kromosomala DNA-dubbelsträngsbrott in vivo" . PLOS ETT . 6 (12): e28756. Bibcode : 2011PLoSO...628756O . doi : 10.1371/journal.pone.0028756 . PMC 3237495 . PMID 22194904 .
  27. ^ a b    Crameri A, Dawes G, Rodriguez E, Silver S, Stemmer WP (maj 1997). "Molekylär utveckling av en arsenatavgiftningsväg genom DNA-blandning". Natur Bioteknik . 15 (5): 436–438. doi : 10.1038/nbt0597-436 . PMID 9131621 . S2CID 25669058 .
  28. ^ a b    Kanada KA, Iwashita S, Shim H, Wood TK (januari 2002). "Riktad utveckling av toluen-orto-monooxygenas för förbättrad 1-naftolsyntes och nedbrytning av klorerad eten" . Journal of Bakteriologi . 184 (2): 344–349. doi : 10.1128/JB.184.2.344-349.2002 . PMC 139589 . PMID 11751810 .
  29. ^ a b    Koerber JT, Jang JH, Schaffer DV (oktober 2008). "DNA-shuffling av adenoassocierat virus ger funktionellt olika viral avkomma" . Molekylär terapi . 16 (10): 1703–1709. doi : 10.1038/mt.2008.167 . PMC 2683895 . PMID 18728640 .
  30. ^ a b c d e    Esteban O, Woodyer RD, Zhao H (2003). "DNA-rekombination in vitro genom slumpmässig priming". I Arnold FH, Georgiou G (red.). Regisserad Evolution Library Creation . Metoder i molekylärbiologi. Vol. 231. Totowa, NJ: Humana Press. s. 99–104. doi : 10.1385/1-59259-395-x:99 . ISBN 978-1-59259-395-8 . PMID 12824607 .
  31. ^    Zhao H, Giver L, Shao Z, Affholter JA, Arnold FH (mars 1998). "Molekylär evolution genom stegrad förlängningsprocess (StEP) in vitro-rekombination". Natur Bioteknik . 16 (3): 258–261. doi : 10.1038/nbt0398-258 . PMID 9528005 . S2CID 20490024 .
  32. ^    Aguinaldo AM, Arnold FH (2003). "Staggered extension process (StEP) in vitro rekombination". I Arnold FH, Georgiou G (red.). Regisserad Evolution Library Creation . Metoder i molekylärbiologi. Vol. 231. Totowa, NJ: Humana Press. s. 105–110. doi : 10.1385/1-59259-395-X:105 . ISBN 978-1-59259-395-8 . PMID 12824608 .
Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=DNA_shuffling&oldid=1091108801 "