Taq polymeras
| DNA-polymeras I, termostabilt | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 stort (Klenow) fragment av Taq polA, innehållande polA och rudimentala domäner
| |||||||
| Identifierare | |||||||
| Organism | |||||||
| Symbol | polA | ||||||
| UniProt | P19821 | ||||||
| |||||||
Taq- polymeras är ett termostabilt DNA-polymeras I uppkallat efter den termofila eubakteriella mikroorganismen Thermus aquaticus , från vilken den ursprungligen isolerades av Chien et al. 1976. Dess namn förkortas ofta till Taq eller Taq pol . Det används ofta i polymeraskedjereaktionen (PCR), en metod för att kraftigt amplifiera mängden korta segment av DNA .
T. aquaticus är en bakterie som lever i varma källor och hydrotermiska öppningar , och Taq -polymeras identifierades som ett enzym som klarar de proteindenaturerande förhållanden (hög temperatur) som krävs under PCR. Därför ersatte det DNA-polymeraset från E. coli som ursprungligen användes i PCR.
Enzymatiska egenskaper
Taqs optimala temperatur för aktivitet är 75–80 °C, med en halveringstid på mer än 2 timmar vid 92,5 °C, 40 minuter vid 95 °C och 9 minuter vid 97,5 °C, och kan replikera ett 1000 baspar DNA-sträng på mindre än 10 sekunder vid 72 °C. Vid 75–80 °C Taq sin optimala polymerisationshastighet på cirka 150 nukleotider per sekund per enzymmolekyl, och alla avvikelser från det optimala temperaturintervallet hämmar förlängningshastigheten för enzymet. En enda Taq syntetiserar cirka 60 nukleotider per sekund vid 70 °C, 24 nukleotider/sekund vid 55 °C, 1,5 nukleotider/sekund vid 37 °C och 0,25 nukleotider/sekund vid 22 °C. Vid temperaturer över 90 °C Taq mycket liten eller ingen aktivitet alls, men själva enzymet denaturerar inte och förblir intakt. Närvaron av vissa joner i reaktionskärlet påverkar också enzymets specifika aktivitet. Små mängder kaliumklorid (KCl) och magnesiumjon (Mg 2+ ) främjar Taqs enzymatiska aktivitet. Taq -polymeras aktiveras maximalt vid 50 mM KCl och precis rätt koncentration av Mg 2+ som bestäms av koncentrationen av nukleosidtrifosfater (dNTP). Höga koncentrationer av KCl och Mg 2+ hämmar Taqs aktivitet. Intressant nog binder den vanliga metalljonkelatorn, EDTA , direkt till Taq i frånvaro av dessa metalljoner.
En av Taqs nackdelar är dess brist på 3' till 5' exonukleas korrekturläsningsaktivitet , vilket resulterar i relativt låg replikationstrohet. Ursprungligen uppmättes dess felfrekvens till cirka 1 av 9 000 nukleotider. Vissa termostabila DNA-polymeraser har isolerats från andra termofila bakterier och archaea, såsom Pfu DNA-polymeras , som har en korrekturläsande aktivitet, och används istället för (eller i kombination med) Taq för högtrohetsförstärkning. Fidelity kan variera mycket mellan Taqs, vilket har djupgående effekter i nedströms sekvenseringstillämpningar.
Taq gör DNA-produkter som har A ( adenin ) överhäng i sina 3'-ändar. Detta kan vara användbart vid TA-kloning , varvid en kloningsvektor (såsom en plasmid ) som har ett T ( tymin ) 3'-överhäng används, vilket kompletterar med A-överhänget av PCR-produkten, vilket möjliggör ligering av PCR-produkten in i plasmidvektorn.
I PCR
I början av 1980-talet arbetade Kary Mullis på Cetus Corporation med tillämpningen av syntetiska DNA på bioteknik . Han var bekant med användningen av DNA- oligonukleotider som prober för att binda till mål-DNA-strängar, såväl som deras användning som primers för DNA-sekvensering och cDNA -syntes. År 1983 började han använda två primrar, en för att hybridisera till varje sträng av ett mål-DNA, och lägga till DNA-polymeras till reaktionen. Detta ledde till exponentiell DNA-replikation , vilket kraftigt amplifierade diskreta segment av DNA mellan primrarna.
Men efter varje replikeringsrunda måste blandningen värmas till över 90 °C för att denaturera det nybildade DNA:t, vilket gör att strängarna kan separeras och fungera som mallar i nästa omgång av amplifiering. Detta uppvärmningssteg inaktiverar också DNA-polymeraset som användes före upptäckten av Taq -polymeras, Klenow-fragmentet (från E. coli ). Taq- polymeras är väl lämpat för denna applikation eftersom det kan motstå temperaturen på 95 °C som krävs för DNA-strängseparation utan att denatureras.
Användning av den termostabila Taq gör det möjligt att köra PCR vid hög temperatur (~60 °C och högre), vilket underlättar hög specificitet för primrarna och minskar produktionen av ospecifika produkter, såsom primerdimer . Användning av ett termostabilt polymeras eliminerar också behovet av att lägga till nytt enzym till varje omgång av termocykling. Ett enda stängt rör i en relativt enkel maskin kan användas för att genomföra hela processen. Användningen av Taq -polymeras var således nyckelidén som gjorde PCR tillämpbar på en mängd olika molekylärbiologiska problem rörande DNA-analys.
Patentfrågor
Hoffmann-La Roche köpte så småningom PCR- och Taq -patenten från Cetus för 330 miljoner dollar, från vilka man kan ha fått upp till 2 miljarder dollar i royalties. 1989 utsåg Science Magazine Taq- polymeras till sin första " Årets molekyl ". Kary Mullis fick Nobelpriset i kemi 1993, det enda som tilldelades för forskning utförd på ett bioteknikföretag . I början av 1990-talet användes PCR-tekniken med Taq -polymeras inom många områden, inklusive grundläggande molekylärbiologisk forskning, kliniska tester och kriminalteknik . Det började också hitta en angelägen tillämpning för direkt upptäckt av hiv i AIDS .
I december 1999 beslutade USA:s distriktsdomare Vaughn Walker att 1990 års patent som involverade Taq -polymeras utfärdades, delvis, på vilseledande information och falska påståenden av forskare med Cetus Corporation . Domen stödde en utmaning från Promega Corporation mot Hoffman-La Roche , som köpte Taq -patenten 1991. Domare Walker citerade tidigare upptäckter från andra laboratorier, inklusive laboratoriet av professor John Trela vid University of Cincinnati avdelning för biologiska vetenskaper, som grund för avgörandet.
Domänstruktur
| Taq-polymeras, exonukleas | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Fullständigt Taq- DNA-polymeras bundet till en DNA-
| |||||||||
| oktameridentifierare | |||||||||
| Symbol | Taq-exonuc | ||||||||
| Pfam | PF09281 | ||||||||
| InterPro | IPR015361 | ||||||||
| SCOP2 | 1qtm / SCOPe / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Taq PolA har en övergripande struktur som liknar den för E. coli PolA. Den mellersta 3'–5' exonukleasdomänen som ansvarar för korrekturläsning har ändrats dramatiskt och är inte funktionell. Den har en funktionell 5'-3' exonukleasdomän vid aminoterminalen, beskriven nedan. De återstående två domänerna verkar i samordning, via kopplad domänrörelse.
Exonukleasdomän
Taq- polymerasexonukleas är en domän som finns i aminoterminalen av Taq DNA- polymeras I (termostabil). Det antar ett ribonukleas H-liknande motiv . Domänen ger 5'- 3' exonukleasaktivitet till polymeraset.
Till skillnad från samma domän i E. coli , som skulle bryta ned primers och måste avlägsnas genom digestion för PCR-användning, sägs denna domän inte bryta ned primern. Denna aktivitet används i TaqMan -proben: när dottersträngarna bildas kommer proberna som är komplementära till mallen i kontakt med polymeraset och klyvs till fluorescerande bitar.
Bindning med DNA
Taq- polymeras är bundet vid dess aktiva polymeras-klyfta med den trubbiga änden av duplex-DNA. Eftersom Taq -polymeraset är i kontakt med det bundna DNA:t bildar dess sidokedjor vätebindningar med DNA:ts puriner och pyrimidiner. Samma region av Taq -polymeras som har bundit till DNA binder också med exonukleas. Dessa strukturer bundna till Taq'ghuuhuhuhuhuhu'-polymeraset har olika interaktioner.
Mutanter
Ett platsriktat mutagenesexperiment som förbättrar den rudimentala 3'-5'-exonukleasaktiviteten med en faktor 2 har rapporterats, men det rapporterades aldrig huruvida detta minskar felfrekvensen. Efter en liknande tankegång har chimärproteiner tillverkats genom att plocka körsbärsdomäner från E. coli , Taq och T. neapolitana polymeras I. Genom att byta ut den rudimentala domänen mot en funktionell från E. coli skapades ett protein med bevis- läsförmåga men en lägre optimal temperatur och låg termostabilitet.
Versioner av polymeraset utan 5'-3' exonukleasdomänen har producerats, bland vilka Klentaq eller Stoffel -fragmentet är mest kända. Den fullständiga avsaknaden av exonukleasaktivitet gör dessa varianter lämpliga för primers som uppvisar sekundär struktur såväl som för kopiering av cirkulära molekyler. Andra varianter inkluderar användning av Klentaq med ett högtroget polymeras, ett termosequenas som känner igen substrat som T7 DNA-polymeras gör, mutanter med högre toleranser mot inhibitorer eller "domänmärkta" versioner som har ett extra helix-hårnåls-helix-motiv runt katalytiken plats för att hålla DNA mer tätt trots ogynnsamma förhållanden.
Betydelse vid upptäckt av sjukdomar
På grund av förbättringarna som Taq -polymeras tillhandahålls i PCR-DNA-replikation: högre specificitet, färre ospecifika produkter och enklare processer och utrustning, har det varit avgörande för ansträngningarna att upptäcka sjukdomar. "Användningen av Polymerase Chain Reaction (PCR) vid diagnostik av infektionssjukdomar har resulterat i en förmåga att tidigt diagnostisera och behandla sjukdomar på grund av kräsna patogener, bestämma den antimikrobiella känsligheten hos långsamt växande organismer och fastställa infektionsmängden." Implementeringen av Taq- polymeras har räddat otaliga liv. Det har spelat en viktig roll i upptäckten av många av världens värsta sjukdomar, inklusive: tuberkulos, streptokockfaryngit, atypisk lunginflammation, AIDS, mässling, hepatit och ulcerösa urogenitala infektioner. PCR, metoden som används för att återskapa kopior av specifika DNA-prover, gör sjukdomsdetektering möjlig genom att rikta in en specifik DNA-sekvens av en riktad patogen från en patients prov och förstärka spårmängder av de indikativa sekvenserna genom att kopiera dem upp till miljarder gånger. Även om detta är den mest exakta metoden för sjukdomsdetektering, särskilt för HIV, utförs den inte lika ofta som alternativa, sämre tester på grund av den relativt höga kostnaden, arbetskraften och tiden som krävs.
Beroendet på Taq -polymeras som en katalysator för PCR-replikationsprocessen har belysts under covid-19- pandemin 2020. Brist på det nödvändiga enzymet har försämrat förmågan hos länder över hela världen att producera testkit för viruset. Utan Taq- polymeras är sjukdomsdetekteringsprocessen mycket långsammare och tråkig.
Trots fördelarna med att använda Taq -polymeras vid PCR-sjukdomsdetektion är enzymet inte utan sina brister. Retrovirala sjukdomar (HIV, HTLV-1 och HTLV-II) inkluderar ofta mutationer från guanin till adenin i deras genom. Mutationer som dessa är det som gör att PCR-tester kan upptäcka sjukdomarna men Taq -polymerasets relativt låga trohetsgrad gör att samma G-till-A-mutation inträffar och möjligen ger ett falskt positivt testresultat.
