Övergående uttryck

Övergående uttryck , oftare kallat " transient genuttryck ", är det tillfälliga uttrycket av gener som uttrycks under en kort tid efter att nukleinsyra , oftast plasmid - DNA som kodar för en expressionskassett , har införts i eukaryota celler med ett kemiskt tillförselmedel. som kalciumfosfat (CaPi) eller polyetylenimin (PEI). Men till skillnad från "stabilt uttryck" smälter det främmande DNA inte ihop med värdcellens DNA, vilket resulterar i den oundvikliga förlusten av vektorn efter flera cellreplikationscykler. Majoriteten av övergående genuttryck görs med odlade djurceller. Tekniken används även i växtceller; emellertid kräver överföringen av nukleinsyror till dessa celler andra metoder än de med djurceller. I både växter och djur bör övergående uttryck resultera i en tidsbegränsad användning av överförda nukleinsyror, eftersom varje långtidsuttryck skulle kallas "stabilt uttryck".

Metodiken varierar beroende på vilken organism som ska transformeras . Medan växter kan transformeras med en konstruktion som introduceras i Agrobacterium tumefaciens via agroinfiltration eller blomdopp, skulle de flesta djurceller kräva en viral vektor . Hos människor utvecklades området för övergående transformation snabbt under covid-19- pandemin 2020–2021 med stora covid-19-vacciner med användning av antingen direkt mRNA-överföring till humana eller adenovirusvektorer , där RNA uttrycks i värdmänniskan för att producera spikproteiner som inducera ett immunsvar.

Fördelar

När man väljer mellan att inducera övergående eller stabilt uttryck i celler, måste tidsram och experimentellt mål beaktas. Transient transfekterade celler används ofta för att studera effekterna av kortvarigt genuttryck, utföra RNA-interferens (RNAi)-medierad gentystnad eller snabbt generera småskaliga rekombinanta proteiner. Denna snabba generering av små mängder av rekombinanta proteiner kan användas för att utvärdera deras potential som läkemedelskandidater eller undersöka deras integritet hos konstruktioner under stadier av vektorutveckling. Dessutom kan övergående uttryck vara ett användbart verktyg när man strävar efter att optimera utvalda parametrar innan de genomgår den tidskrävande processen med uppskalning i stabilt transfekterade celler. Typiskt skördas cellerna inom 1-4 dagar efter framgångsrik transfektion. För ännu snabbare resultat kan ersättning av DNA med mRNA resultera i övergående uttryck inom några minuter efter framgångsrik transfektion i vissa system; denna process kringgår translokation till kärnan och transkription .

Om stabilt, långsiktigt genuttryck önskas, är stabil transfektion av celler mer användbar. Men eftersom framgångsrik integrering av en DNA-vektor i kromosomen är en sällsynt företeelse, är denna process svårare och mer tidskrävande och är reserverad för storskalig proteinproduktion, genterapier och långtidsstudier av farmakologi.

Uttryck i växtceller

Agrobacterium-medierad genetisk transformation

(a) Avbildar processen att avväpna den Agrobacteria-tumörinducerande plasmiden och fusion med växtvirala regulatoriska sekvenser. (b) Visar samuttryck via infiltration av flera Agrobacteria-kulturer som innehåller separata binära vektorer eller kulturer som har enstaka vektorer som innehåller multipla expressionskassetter.

Den dominerande teknologin som används för produktion av transgena växter för transient uttryck är Agrobacterium -medierad genetisk transformation, eller "agroinfiltration", och virusuttrycksmaskineri. Agrobacterium tumefaciens och besläktade Agrobacterium -arter är välkända växtpatogener som har konstruerats för att effektivt överföra specifika bitar av DNA (kallas överförings-DNA, eller T-DNA) till växtkärnan med hjälp av binära vektorsystem, som består av en T - DNA - binär vektor och en vir- hjälparplasmid. Denna binära vektor separerar T-DNA från transverkande virulensproteiner som hjälper till att förmedla överföringen. Fördelarna med denna metod inkluderar modularitet av plasmider med brett värdområde av liten storlek genom standardtekniker för molekylärbiologi. Eftersom den modertumörinducerande plasmiden i Agrobacterium -stammar har avväpnats och endast icke-reproduktiva celler har modifierats (i motsats till modifieringar av könslinje), anses processen vara miljömässigt ofarlig.

Tillämpningar av denna process har resulterat i framsteg i användningen av växter till syntetisk biologi. Växthärledda bioprodukter visar löfte om hög konkurrenskraft gentemot traditionella däggdjurscellexpressionssystem.

Uttryck i däggdjursceller

Däggdjurscellexpressionssystem är väsentliga för den övergående produktionen av rekombinanta proteiner och deras komplementära posttranslationella modifieringar. I själva verket produceras ungefär hälften av de nuvarande kommersiellt tillgängliga terapeutiska proteinerna i däggdjursceller. Men däggdjurscellsystems långsamma tillväxt, exakta tillväxtkrav och potentiella risk för infektion av djurvirus utgör ett antal utmaningar. Som ett resultat har ett växande antal däggdjurscellinjer etablerats för att fungera som värdar för transient rekombinant proteinproduktion.

HEK293-celler

Även om andra cellinjer, såsom afrikansk grön apa njure (COS) och baby hamster njure (BHK), kan användas för rekombinant proteinproduktion, involverar det vanligast använda värdsystemet vid övergående uttryck av däggdjursceller derivat av cellinjen HEK293 , som är baserad på den mänskliga embryonala njurcellinjen etablerad 1977 av Graham et al. HEK293-cellinjen skapades via transformation med klippt Adenovirus 5-DNA. Fördelarna med att använda denna cellinje inkluderar deras höga transfektionshastigheter och förmåga att växa i ett serumfritt medium, vilket resulterar i minskade kostnader och minskad risk för kontaminering med material från djur som vanligtvis finns i serum.

Flera konstruerade sublines utvecklades senare genom att inkorporera virala element som härrör från däggdjursvirus, såsom SV40-virus eller Epstein-Barr-virus (EBV), som är anmärkningsvärda för sin höga retention av plasmid-DNA i ett episomalt tillstånd och sin förmåga att öka transkription och translation via specifika virala egenskaper. Dessa senare sublinjer identifierades följaktligen ha två interagerande komponenter: SV40 stora T-antigenet som binder till SV20-replikationsstartpunkten (SV40 ori ) och det EBV-härledda nukleära antigen-1 ( EBNA-1 )-proteinet till dess associerade replikationsursprung ( oriP).

Typiska historiska utbyten av övergående uttryck i HEK293-celler transfekterade med PEI-25kDa var 20-40 mg/L rekombinant antikroppsprotein. År 2008, Backliwal et. al rapporterade för första gången ger över 1 g/L rekombinant antikroppsprotein.

CHO-celler

Traditionellt är ovarieceller från kinesisk hamster (CHO) förknippade med etableringen av stabila cellinjer för biologiska läkemedel. Nyligen har dock försök att konstruera CHO-celler för transient proteinproduktion fått erkännande. CHO-celler var bland de tidigast etablerade cellinjerna för in vitro-odling, och deras potential som värd för produktion och tillverkning av biologiska produkter är fortfarande populär. CHO-celler är att föredra för övergående uttryck på grund av deras lätta industriella uppskalning, mångsidighet för produktion av olika biomolekyler och låg risk för infektion av humana virus, bland andra fördelar. Tre primära uttryckssystem har etablerats:

  1. EBNA-1-konstruerad CHO-cellinje
  2. CHO EBNA LT-cellinje, som bärs åtskild från EBNA-1-genen och muspolyomavirus stora T-antigenet
  3. Epi CHO-system, som består av en CHO-cellinje transfekterad med genen för polyomavirus large T-antigen och en DNA-expressionsvektor som kodar för polyomavirusursprung ( PyOri ) för autonom replikation och EBV EBNA-1 och OriP för plasmidretention.

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Transient_expression&oldid=1144757139 "