Överför DNA binärt system
Ett binärt transfer-DNA- system ( T-DNA ) är ett par plasmider som består av en binär T-DNA-vektor och en vir -hjälparplasmid . De två plasmiderna används tillsammans (alltså binära ) för att producera genetiskt modifierade växter . De är konstgjorda vektorer som har härletts från den naturligt förekommande Ti-plasmiden som finns i bakteriearter av släktet Agrobacterium , såsom A. tumefaciens . Den binära vektorn är en skyttelvektor , så kallad eftersom den kan replikera i flera värdar (t.ex. Escherichia coli och Agrobacterium ).
System där T-DNA- och vir -gener finns på separata replikoner kallas binära T-DNA-system. T-DNA är lokaliserat på den binära vektorn (icke-T-DNA-regionen av denna vektor som innehåller replikationsursprung som skulle kunna fungera både i E. coli och Agrobacterium , och antibiotikaresistensgener som används för att selektera för närvaron av binär vektor i bakterier, blev känd som vektorryggradssekvenser). Replikonen innehållande vir- generna blev känd som vir- hjälparplasmiden. Vir- hjälparplasmiden anses avväpnad om den inte innehåller onkogener som skulle kunna överföras till en växt.
Binära systemkomponenter
T-DNA binär vektor
Det finns flera binära vektorer som replikerar i Agrobacterium och kan användas för leverans av T-DNA från Agrobacterium till växtceller. T-DNA-delen av den binära vektorn flankeras av vänster och höger kantsekvenser och kan inkludera en transgen såväl som en växtselekterbar markör . Utanför T-DNA:t innehåller den binära vektorn även en bakteriell selekterbar markör och ett replikationsursprung (ori) för bakterier.
Representativa serier av binära vektorer listas nedan.
| Serier | Vektor | År | GenBank anslutning | Storlek (bp) | Autonom replikation i Agrobacterium | Referens |
|---|---|---|---|---|---|---|
| pBIN | pBIN19 | 1984 | U09365 | 11777 | Ja | |
| pPVP | pPZP200 | 1994 | U10460 | 6741 | Ja | |
| pCB | pCB301 | 1999 | AF139061 | 3574 | Ja | |
| pCAMBIA | pCAMBIA-1300 | 2000 | AF234296 | 8958 | Ja | |
| pGrön | pGrön0000 | 2000 | AJ007829 | 3228 | Nej | |
| pLSU | pLSU-1 | 2012 | HQ608521 | 4566 | Ja | |
| pLX | pLX-B2 | 2017 | KY825137 | 3287 | Ja |
Vir- hjälparplasmid
Vir- hjälparplasmiden innehåller vir -gener som härstammar från Ti-plasmiden från Agrobacterium . Dessa gener kodar för en serie proteiner som skär den binära vektorn vid vänster och höger gränssekvens, och underlättar överföring och integration av T-DNA till växtens celler respektive genom.
Flera vir- hjälparplasmider har rapporterats, och vanliga Agrobacterium- stammar som inkluderar vir- hjälparplasmider är:
- EHA101
- EHA105
- AGL-1
- LBA4404
- GV2260
Utveckling av binära T-DNA-vektorer
pBIN19-vektorn utvecklades på 1980-talet och är en av de första och mest använda binära vektorerna. pGreen-vektorn, som utvecklades 2000, är en nyare version av den binära vektorn som möjliggör ett urval av promotorer, valbara markörer och reportergener. En annan utmärkande egenskap hos pGreen är dess stora minskning i storlek (från cirka 11,7 kbp till 4,6 kbp) från pBIN19, vilket ökar dess transformationseffektivitet .
Tillsammans med högre transformationseffektivitet har pGreen konstruerats för att säkerställa transformationsintegritet. Både pBIN19 och pGreen använder vanligtvis samma valbara markör nptII , men pBIN19 har den valbara markören bredvid den högra kanten, medan pGreen har den nära den vänstra kanten. På grund av en polaritetsskillnad i de vänstra och högra gränserna kommer den högra gränsen av T-DNA:t först in i värdväxten. Om den selekterbara tillverkaren är nära den högra gränsen (som är fallet med pBIN19) och transformationsprocessen avbryts, kan den resulterande växten ha uttryck av en selekterbar markör men inte innehålla något T-DNA som ger ett falskt positivt. pGreen-vektorn har den selekterbara markören som kommer in i värden sist (på grund av dess placering bredvid den vänstra gränsen) så varje uttryck av markören kommer att resultera i fullständig transgenintegration.
De pGreen-baserade vektorerna är inte autonoma och de kommer inte att replikera i Agrobacterium om pSoup inte är närvarande. Serier av små binära vektorer som autonomt replikerar i E. coli och Agrobacterium inkluderar:
- pCB
- pLSU
- pLX