Tvådimensionell kromatografi
Tvådimensionell kromatografi är en typ av kromatografisk teknik där det injicerade provet separeras genom att passera genom två olika separationssteg. Två olika kromatografiska kolonner ansluts i sekvens, och utflödet från det första systemet överförs till den andra kolonnen. Typiskt har den andra kolonnen en annan separationsmekanism, så att band som är dåligt upplösta från den första kolonnen kan separeras helt i den andra kolonnen. (Till exempel kan en C18 omvänd-fas-kromatografikolonn följas av en fenylkolonn.) Alternativt kan de två kolonnerna köras vid olika temperaturer. Under det andra steget av separationen måste hastigheten med vilken separationen sker vara snabbare än det första steget, eftersom det fortfarande bara finns en enda detektor. Den plana ytan är mottaglig för sekventiell utveckling i två riktningar med användning av två olika lösningsmedel.
Historia
Moderna tvådimensionella kromatografiska tekniker är baserade på resultaten av den tidiga utvecklingen av papperskromatografi och tunnskiktskromatografi som involverade flytande mobila faser och fasta stationära faser. Dessa tekniker skulle senare generera modern gaskromatografi och vätskekromatografianalys . Olika kombinationer av endimensionell GC och LC producerade den analytiska kromatografiska tekniken som är känd som tvådimensionell kromatografi.
Den tidigaste formen av 2D-kromatografi kom i form av en flerstegs TLC- separering där ett tunt ark av cellulosa först används med ett lösningsmedel i en riktning, sedan, efter att papperet har torkats, körs ett annat lösningsmedel i en riktning i rät vinkel mot den första. Denna metod dök först upp i litteraturen med en publikation från 1944 av AJP Martin och medarbetare som beskriver en effektiv metod för att separera aminosyror- "...men det tvådimensionella kromatogrammet är särskilt bekvämt, eftersom det i ett ögonkast visar information som kan vara vunnit på annat sätt endast som ett resultat av många experiment" (Biochem J., 1944, 38, 224).
Exempel
Tvådimensionella separationer kan utföras i gaskromatografi eller vätskekromatografi . Olika olika kopplingsstrategier har utvecklats för att "omsampla" från den första kolumnen till den andra. Viktig hårdvara för tvådimensionella separationer är Deans' switch och Modulator, som selektivt överför den första dimensionens eluent till den andra dimensionens kolumn
Den främsta fördelen med tvådimensionella tekniker är att de erbjuder en stor ökning av toppkapaciteten, utan att kräva extremt effektiva separationer i någon av kolumnerna. (Till exempel, om den första kolonnen erbjuder en toppkapacitet (k 1 ) på 100 för en 10-minuters separation, och den andra kolonnen erbjuder en toppkapacitet på 5 (k 2 ) i en 5-sekunders separation, då den kombinerade toppen kapaciteten kan närma sig k 1 × k 2 =500, med den totala separationstiden fortfarande ~ 10 minuter). 2D-separationer har använts för analys av bensin och andra petroleumblandningar, och på senare tid för proteinblandningar.
Tandemmasspektrometri
Tandemmasspektrometri (Tandem MS eller MS/MS) använder två massanalysatorer i sekvens för att separera mer komplexa blandningar av analyter. Fördelen med tandem MS är att det kan vara mycket snabbare än andra tvådimensionella metoder, med tider som sträcker sig från millisekunder till sekunder. Eftersom det inte finns någon utspädning med lösningsmedel i MS, är det mindre sannolikhet för interferens, så tandem MS kan vara känsligare och ha ett högre signal-brusförhållande jämfört med andra tvådimensionella metoder. Den största nackdelen förknippad med tandem MS är den höga kostnaden för den instrumentering som behövs. Priserna kan variera från $500 000 till över $1 miljon. Många former av tandem-MS innefattar ett massselektionssteg och ett fragmenteringssteg. Den första massanalysatorn kan programmeras att endast passera molekyler med ett specifikt förhållande mellan massa och laddning. Sedan kan den andra massanalysatorn fragmentera molekylen för att fastställa dess identitet. Detta kan vara särskilt användbart för att separera molekyler med samma massa (dvs proteiner med samma massa eller molekylära isomerer). Olika typer av massanalysatorer kan kopplas för att uppnå varierande effekter. Ett exempel skulle vara ett TOF - Quadrupole system. Joner kan sekventiellt fragmenteras och/eller analyseras i en kvadrupol när de lämnar TOF i ordningsföljd med ökande m/z. En annan vanlig tandemmasspektrometer är quadrupol-quadrupole-quadrupole (QQQ) analysatorn. Den första kvadrupolen separeras med massa, kollisioner äger rum i den andra kvadrupolen och fragmenten separeras med massa i den tredje kvadrupolen.
Gaskromatografi-masspektrometri
Gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) är en tvådimensionell kromatografiteknik som kombinerar separationstekniken för gaskromatografi med identifieringstekniken för masspektrometri . GC-MS är det enskilt viktigaste analysverktyget för analys av flyktiga och halvflyktiga organiska föreningar i komplexa blandningar. Det fungerar genom att först injicera provet i GC-inloppet där det förångas och trycks genom en kolonn av en bärargas, vanligtvis helium. Analyterna i provet separeras baserat på deras interaktion med beläggningen av kolonnen, eller den stationära fasen, och bärargasen, eller den mobila fasen. Föreningarna som elueras från kolonnen omvandlas till joner via elektronstöt (EI) eller kemisk jonisering (CI) innan de färdas genom massanalysatorn. Massanalysatorn tjänar till att separera jonerna på en massa-till-laddning-basis. Populära val har samma funktion men skiljer sig åt på det sätt som de åstadkommer separationen. Analysatorerna som vanligtvis används med GC-MS är flygtids-massanalysatorn och kvadrupolmassanalysatorn . Efter att ha lämnat massanalysatorn når analyterna detektorn och producerar en signal som läses av en dator och används för att skapa ett gaskromatogram och masspektrum. Ibland använder GC-MS två gaskromatografer i särskilt komplexa prover för att erhålla avsevärd separationsförmåga och otvetydigt kunna tilldela den specifika arten till lämpliga toppar i en teknik som kallas GCxGC-(MS). I slutändan är GC-MS en teknik som används i många analytiska laboratorier och är ett mycket effektivt och anpassningsbart analysverktyg.
Vätskekromatografi-masspektrometri
Vätskekromatografi-masspektrometri (LC/MS) kopplar högupplöst kromatografisk separation med MS-detektion. Eftersom systemet antar den höga separationen av HPLC, joniseras analyter som är i den flytande mobila fasen ofta med olika mjuka joniseringsmetoder inklusive kemisk jonisering vid atmosfärstryck (APCI), elektrosprayjonisering (ESI) eller matrisassisterad laserdesorption/jonisering (MALDI) ), som uppnår den gasfasjonisering som krävs för kopplingen med MS. [ citat behövs ] Dessa joniseringsmetoder tillåter analys av ett bredare utbud av biologiska molekyler, inklusive de med större massor, termiskt instabila eller icke-flyktiga föreningar där GC-MS vanligtvis inte kan analysera.
LC-MS ger hög selektivitet eftersom olösta toppar kan isoleras genom att välja en specifik massa. Dessutom uppnås bättre identifiering också med masspektra och användaren behöver inte förlita sig enbart på analyternas retentionstid. Som ett resultat kan molekylär massa och strukturell information såväl som kvantitativa data erhållas via LC-MS. LC-MS kan därför tillämpas på olika områden, såsom föroreningsidentifiering och profilering vid läkemedelsutveckling och läkemedelstillverkning, eftersom LC ger effektiv separering av föroreningar och MS ger strukturell karakterisering för föroreningsprofilering.
Vanliga lösningsmedel som används i normal eller omvänd fas LC såsom vatten, acetonitril och metanol är alla kompatibla med ESI, men ett lösningsmedel av LC-kvalitet kanske inte är lämpligt för MS. Dessutom bör buffertar som innehåller oorganiska joner undvikas eftersom de kan kontaminera jonkällan. Icke desto mindre kan problemet lösas med 2D LC-MS, såväl som andra olika problem, inklusive analytsameluering och UV-detektionssvar.
Vätskekromatografi-vätskekromatografi
Tvådimensionell vätskekromatografi (2D-LC) kombinerar två separata analyser av vätskekromatografi till en dataanalys. Modern 2-D vätskekromatografi har sitt ursprung i slutet av 1970-talet till början av 1980-talet. Under denna tid bevisades de hypotetiska principerna för 2D-LC genom experiment som utfördes tillsammans med kompletterande konceptuellt och teoretiskt arbete. Det visades att 2D-LC kunde erbjuda ganska mycket mer upplösningsförmåga jämfört med de konventionella teknikerna för endimensionell vätskekromatografi. På 1990-talet spelade tekniken för 2D-LC en viktig roll i separationen av extremt komplexa ämnen och material som finns inom proteomik och polymerstudier. Tyvärr hade tekniken visat sig ha en betydande nackdel när det gällde analystid. Tidigt arbete med 2D-LC var begränsat till en liten del av vätskefasseparationer på grund av maskinens långa analystid. Moderna 2D-LC-tekniker tacklade den nackdelen direkt och har avsevärt minskat det som en gång var en skadlig funktion. Modern 2D-LC har en instrumentell kapacitet för högupplösta separationer som ska slutföras på en timme eller mindre. På grund av det växande behovet av instrumentering för att utföra analyser av ämnen med växande komplexitet med bättre detektionsgränser, drivs utvecklingen av 2D-LC framåt. Instrumentella delar har blivit ett vanligt industrifokus och är mycket lättare att uppnå än tidigare. Dessförinnan utfördes 2D-LC med hjälp av komponenter från 1D-LC-instrument, och skulle leda till resultat av varierande grad i både noggrannhet och precision. Den minskade stressen på instrumentteknik har möjliggjort banbrytande arbete inom området och tekniken för 2D-LC.
Syftet med att använda denna teknik är att separera blandningar som endimensionell vätskekromatografi annars inte kan separera effektivt. Tvådimensionell vätskekromatografi är bättre lämpad för att analysera komplexa blandningsprover som urin, miljöämnen och rättsmedicinska bevis som blod.
Svårigheter att separera blandningar kan hänföras till blandningens komplexitet i den meningen att separation inte kan ske på grund av antalet olika utflöden i föreningen. Ett annat problem förknippat med endimensionell vätskekromatografi involverar svårigheten förknippad med att lösa upp närbesläktade föreningar. Närbesläktade föreningar har liknande kemiska egenskaper som kan visa sig svåra att separera baserat på polaritet, laddning, etc. Tvådimensionell vätskekromatografi ger separation baserat på mer än en kemisk eller fysikalisk egenskap. Med hjälp av ett exempel från Nagy och Vekey kan en blandning av peptider separeras baserat på deras basicitet, men liknande peptider kanske inte eluerar väl. Genom att använda en efterföljande LC-teknik kan den liknande basiciteten mellan peptiderna separeras ytterligare genom att använda skillnader i apolär karaktär.
Som ett resultat, för att kunna separera blandningar mer effektivt, måste en efterföljande LC-analys använda mycket olika separationsselektivitet i förhållande till den första kolonnen. Ett annat krav för att effektivt använda 2D-vätskekromatografi, enligt Bushey och Jorgenson, är att använda mycket ortogonala tekniker vilket innebär att de två separationsteknikerna måste vara så olika som möjligt.
Det finns två huvudklassificeringar av 2D-vätskekromatografi. Dessa inkluderar: Omfattande 2D-vätskekromatografi (LCxLC) och hjärtskärande 2D-vätskekromatografi (LC-LC). I omfattande 2D-LC är alla toppar från en kolonneluering fullständigt provtagna, men det har ansetts onödigt att överföra hela provet från den första till den andra kolumnen. En del av provet skickas till avfall medan resten skickas till provtagningsventilen. I hjärtskärande 2D-LC målinriktas specifika toppar med endast en liten del av toppen som injiceras på en andra kolonn. Hjärtskärande 2D-LC har visat sig vara ganska användbar för provanalys av ämnen som inte är särskilt komplexa förutsatt att de har liknande retentionsbeteende. Jämfört med omfattande 2D-LC ger hjärtskärande 2D-LC en effektiv teknik med mycket mindre systeminställningar och mycket lägre driftskostnad. Multipel hjärtskärning (mLC-LC) kan användas för att ta prov på flera toppar från förstadimensionell analys utan att riskera tillfällig överlappning av andradimensionell analys. Multipel hjärtskärning (mLC-LC) använder en uppsättning av flera samplingsloopar.
För 2D-LC är toppkapacitet en mycket viktig fråga. Detta kan genereras med användning av gradientelueringsseparation med mycket större effektivitet än en isokratisk separation givet en rimlig tid. Även om isokratisk eluering är mycket lättare på en snabb tidsskala, är det föredraget att utföra en gradientelueringsseparation i den andra dimensionen. Den mobila fasens styrka varieras från en svag eluentkomposition till en starkare. Baserat på teorin om linjär lösningsmedelsstyrka (LSST) för gradienteluering för kromatografi med omvänd fas, visas förhållandet mellan retentionstid, instrumentella variabler och parametrar för löst ämne nedan.
- 0000 tR =t +t D + t / b *ln(b*(k -td / t ) + 1)
Även om mycket banbrytande arbete har slutförts under åren sedan 2D-LC blev en viktig analytisk kromatografiteknik, finns det fortfarande många moderna problem att ta hänsyn till. Stora mängder experimentella variabler har ännu inte fattats, och tekniken är ständigt under utveckling.
Gaskromatografi - gaskromatografi
Omfattande tvådimensionell gaskromatografi är en analysteknik som separerar och analyserar komplexa blandningar. Det har använts inom områden som: smak, doft, miljöstudier, läkemedel, petroleumprodukter och kriminalteknisk vetenskap. GCxGC ger ett högt känslighetsområde och ger en större separationseffekt på grund av den ökade toppkapaciteten.
