Förskjutningskromatografi

Förskjutningskromatografi är en kromatografiteknik där ett prov placeras på kolonnens huvud och sedan ersätts av ett löst ämne som är starkare sorberat än komponenterna i den ursprungliga blandningen. Resultatet är att komponenterna löses upp i på varandra följande "rektangulära" zoner av högkoncentrerade rena ämnen snarare än lösningsmedelsseparerade "toppar". Det är i första hand en förberedande teknik; högre produktkoncentration, högre renhet och ökad genomströmning kan erhållas jämfört med andra kromatografisätt.

Upptäckt

Tillkomsten av förskjutningskromatografi kan tillskrivas Arne Tiselius , som 1943 först klassificerade kromatografins sätt som frontal, eluering och förskjutning. Förskjutningskromatografi fann en mängd olika tillämpningar inklusive isolering av transuraniska element och biokemiska enheter. Tekniken utvecklades om av Csaba Horváth , som använde moderna högtryckskolonner och utrustning. Det har sedan dess funnit många tillämpningar, särskilt inom området för biologisk rening av makromolekyler.

Princip

Exempel på en Langmuir-isoterm, för en population av bindningsställen med enhetlig affinitet. I detta fall representerar den vertikala axeln mängden bunden per enhet av stationär fas, den horisontella axeln koncentrationen i den mobila fasen. I detta fall är dissociationskonstanten 0,5 och kapaciteten 10; enheter är godtyckliga.

Den grundläggande principen för förskjutningskromatografi är: det finns bara ett ändligt antal bindningsställen för lösta ämnen på matrisen (den stationära fasen), och om ett ställe är upptaget av en molekyl är det inte tillgängligt för andra. Som i all kromatografi etableras jämvikt mellan molekyler av ett givet slag bundna till matrisen och de av samma slag fria i lösning. Eftersom antalet bindningsställen är ändligt, när koncentrationen av fria molekyler i lösning är stor i förhållande till dissociationskonstanten för ställena, kommer dessa ställen för det mesta att fyllas. Detta resulterar i en krökning nedåt i plotten av bundet vs fritt löst ämne, vilket i det enklaste fallet ger en Langmuir-isoterm . En molekyl med hög affinitet för matrisen (förträngaren) kommer att konkurrera mer effektivt om bindningsställen, vilket lämnar den mobila fasen anrikad på det lösta ämnet med lägre affinitet. Flödet av mobil fas genom kolonnen bär företrädesvis bort det lösta ämnet med lägre affinitet och vid hög koncentration kommer det lösta ämnet med högre affinitet så småningom att ersätta alla molekyler med lägre affiniteter.

Driftsätt

Läser in

I början av körningen appliceras en blandning av lösta ämnen som ska separeras på kolonnen, under betingelser valda för att främja hög retention. De lösta ämnena med högre affinitet hålls företrädesvis kvar nära kolonnens huvud, med de lösta ämnena med lägre affinitet som rör sig längre nedströms. Den snabbast rörliga komponenten börjar bilda en ren zon nedströms. De andra komponenterna börjar också bilda zoner, men den fortsatta tillförseln av det blandade fodret längst upp i kolonnen förhindrar full upplösning.

Förflyttning

Efter att hela provet har laddats växlas matningen till förskjutningsanordningen, vald för att ha högre affinitet än någon provkomponent. Förskjutaren bildar en skarpkantad zon i toppen av kolonnen, som trycker de andra komponenterna nedströms. Varje provkomponent fungerar nu som en förskjutning för de lösta ämnena med lägre affinitet, och de lösta ämnena sorterar ut sig själva i en serie sammanhängande band (ett "förskjutningståg"), som alla rör sig nedströms med den hastighet som ställs in av förskjutaren. Storleken och belastningen på kolonnen väljs för att låta denna sorteringsprocess slutföras innan komponenterna når botten av kolonnen. De lösta ämnena uppträder i botten av kolonnen som en serie sammanhängande zoner, var och en bestående av en renad komponent, med koncentrationen inom varje enskild zon effektivt enhetlig.

Regeneration

Efter att det sista lösta ämnet har eluerats är det nödvändigt att ta bort förträngningsmedlet från kolonnen. Eftersom förskjutaren valdes för hög affinitet kan detta utgöra en utmaning. På omvändfasmaterial kan det räcka med en tvätt med en hög andel organiskt lösningsmedel. Stora pH-skiftningar används också ofta. En effektiv strategi är att avlägsna förträngningsmedlet genom kemisk reaktion; t.ex. om vätejon användes som undanträngande kan den avlägsnas genom reaktion med hydroxid, eller en flervärd metalljon kan avlägsnas genom reaktion med ett kelatbildande medel. För vissa matriser kan reaktiva grupper på den stationära fasen titreras för att tillfälligt eliminera bindningsställena, till exempel kan svagsyrajonbytare eller kelatbildande hartser omvandlas till den protonerade formen. För jonbytare av geltyp kan selektivitetsomkastning vid mycket hög jonstyrka också ge en lösning. Ibland är förskjutaren specifikt utformad med en titrerbar funktionell grupp för att ändra dess affinitet. Efter att förträngningsmedlet tvättats ut tvättas kolonnen efter behov för att återställa den till dess initiala tillstånd för nästa körning.

Jämförelse med elueringskromatografi

Gemensamma grunder

I någon form av kromatografi är hastigheten med vilken det lösta ämnet rör sig nedåt i kolonnen en direkt återspegling av den procentandel av tiden som det lösta ämnet tillbringar i den mobila fasen. För att uppnå separation i antingen eluerings- eller undanträngningskromatografi måste det finnas avsevärda skillnader i affiniteten för de respektive lösta ämnena för den stationära fasen. Båda metoderna förlitar sig på rörelse nedåt i kolonnen för att förstärka effekten av små skillnader i fördelning mellan de två faserna. Fördelningen mellan den mobila och stationära fasen beskrivs av bindningsisotermen, ett diagram av löst ämne bundet till (eller uppdelat i) den stationära fasen som en funktion av koncentrationen i den mobila fasen. Isotermen är ofta linjär, eller ungefär så, vid låga koncentrationer, men kurvor vanligtvis (konkav-nedåt) vid högre koncentrationer när den stationära fasen blir mättad.

Egenskaper för elueringsläge

I elueringsläge appliceras lösta ämnen på kolonnen som smala band och, vid låg koncentration, rör sig nedåt i kolonnen som ungefärliga Gaussiska toppar. Dessa toppar fortsätter att bredda sig när de färdas, i proportion till kvadratroten av den tillryggalagda sträckan. För att två ämnen ska kunna lösas upp måste de migrera ner i kolonnen med tillräckligt olika hastigheter för att övervinna effekterna av bandspridning. Att arbeta vid hög koncentration, där isotermen är krökt, är ofördelaktig vid elueringskromatografi eftersom rörelsehastigheten då beror på koncentrationen, vilket gör att topparna sprids och förvrängs.

Retention i elueringskromatografi kontrolleras vanligtvis genom att justera sammansättningen av den mobila fasen (i termer av lösningsmedelssammansättning, pH, jonstyrka, och så vidare) enligt typen av stationär fas som används och de speciella lösta ämnen som ska separeras. Komponenterna i den mobila fasen har i allmänhet lägre affinitet för den stationära fasen än de lösta ämnen som separeras, men är närvarande i högre koncentration och uppnår sina effekter på grund av massverkan . Upplösning i elueringskromatografi är i allmänhet bättre när toppar bibehålls starkt, men förhållanden som ger bra upplösning av tidiga toppar leder till långa körtider och överdriven breddning av senare toppar om inte gradienteluering används . Gradientutrustning tillför komplexitet och kostnad, särskilt i stor skala.

Fördelar och nackdelar med förskjutningsläge

I motsats till elueringskromatografi bildar lösta ämnen separerade i förskjutningsläge skarpkantade zoner snarare än spridningstoppar. Zongränser i förskjutningskromatografi är självskärpande: om en molekyl av någon anledning kommer före sitt band, går den in i en zon där den hålls starkare kvar och kommer sedan att gå långsammare tills dess zon kommer ikapp. Eftersom förträngningskromatografi drar fördel av isotermernas icke-linjäritet, är laddningarna avsiktligt höga; mer material kan separeras på en given kolonn, under en given tid, med de renade komponenterna utvunna i betydligt högre koncentrationer. Retentionsförhållandena kan fortfarande justeras, men undanträngaren styr migrationshastigheten för de lösta ämnena. Förskjutningsmedlet väljs för att ha högre affinitet för den stationära fasen än vad någon av de lösta ämnen som separeras gör, och dess koncentration är inställd för att närma sig mättnad av den stationära fasen och för att ge den önskade migrationshastigheten för koncentrationsvågen. Högretentionsförhållanden kan användas utan gradientdrift, eftersom förskjutningen säkerställer avlägsnande av alla lösta ämnen av intresse under den designade körtiden.

På grund av den koncentrerande effekten av att ladda kolonnen under betingelser med hög retention, är undanträngningskromatografi väl lämpad för att rena komponenter från utspädda matningsströmmar. Det är emellertid också möjligt att koncentrera material från en utspädd ström vid toppen av en kromatografisk kolonn och sedan byta betingelser för att eluera det adsorberade materialet i konventionella isokratiska eller gradientlägen. Därför är detta tillvägagångssätt inte unikt för undanträngningskromatografi, även om den högre laddningskapaciteten och mindre utspädningen tillåter större koncentration i förskjutningsläge.

En nackdel med förskjutningskromatografi är att icke-idealiteter alltid ger upphov till en överlappszon mellan varje par av komponenter; denna blandade zon måste samlas in separat för återvinning eller kasseras för att bevara renheten hos de separerade materialen. Strategin att tillsätta spacermolekyler för att bilda zoner mellan komponenterna (ibland benämnd "bärarförskjutningskromatografi") har undersökts och kan vara användbar när lämpliga, lätt borttagbara spacers hittas. En annan nackdel är att det råa kromatogrammet, till exempel ett diagram av absorbans eller brytningsindex vs elueringsvolym, kan vara svårt att tolka för angränsande zoner, speciellt om förskjutningståget inte är fullt utvecklat. Dokumentation och felsökning kan kräva ytterligare kemisk analys för att fastställa fördelningen av en given komponent. En annan nackdel är att tiden som krävs för regenerering begränsar genomströmningen.

Enligt John C. Fords artikel i Encyclopedia of Chromatography indikerar teoretiska studier att åtminstone för vissa system erbjuder optimerad överbelastad elueringskromatografi högre genomströmning än förträngningskromatografi, även om begränsade experimentella tester tyder på att förskjutningskromatografi är överlägsen (åtminstone innan man beaktar regenereringstid).

Ansökningar

Historiskt har förskjutningskromatografi tillämpats på preparativa separationer av aminosyror och sällsynta jordartsmetaller och har även undersökts för isotopseparation.

Proteiner

Den kromatografiska reningen av proteiner från komplexa blandningar kan vara ganska utmanande, särskilt när blandningarna innehåller liknande bibehållna proteiner eller när det är önskvärt att berika spårkomponenter i fodret. Vidare är kolonnbelastningen ofta begränsad när höga upplösningar krävs med traditionella kromatografimetoder (t.ex. linjär gradient, isokratisk kromatografi). I dessa fall är undanträngningskromatografi en effektiv teknik för rening av proteiner från komplexa blandningar vid höga kolonnbelastningar i en mängd olika tillämpningar.

Ett viktigt framsteg inom teknikens ståndpunkt för undanträngningskromatografi var utvecklingen av undanträngare med låg molekylvikt för proteinrening i jonbytessystem. Denna forskning var betydande eftersom den representerade en stor avvikelse från den konventionella visdomen att stora polyelektrolytpolymerer krävs för att ersätta proteiner i jonbytessystem.

Förträngare med låg molekylvikt har betydande driftsfördelar jämfört med stora polyelektrolytförträngare. Till exempel, om det finns någon överlappning mellan undanträngaren och proteinet av intresse, kan dessa lågmolekylära material lätt separeras från det renade proteinet under efterträngningsbearbetning med användning av standardstorleksbaserade reningsmetoder (t.ex. storleksuteslutningskromatografi , ultrafiltrering ) . Dessutom underlättar det saltberoende adsorptionsbeteendet hos dessa lågmolekylära förträngare i hög grad kolonnregenerering. Dessa förskjutningsanordningar har använts för en mängd olika högupplösningsseparationer i jonbytessystem. Dessutom har användbarheten av undanträngningskromatografi för rening av rekombinanta tillväxtfaktorer , antigena vaccinproteiner och antisensoligonukleotider också visats. Det finns flera exempel där undanträngningskromatografi har använts för rening av proteiner med jonbyte , hydrofob interaktion , såväl som omvänd faskromatografi .

Förskjutningskromatografi är väl lämpad för att erhålla mg-kvantiteter av renade proteiner från komplexa blandningar med användning av standardkolonner för analytisk kromatografi i bänkskala. Den är också särskilt väl lämpad för att berika spårkomponenter i fodret. Förskjutningskromatografi kan enkelt utföras med användning av en mängd olika hartssystem inklusive jonbyte, HIC och RPLC

Tvådimensionell kromatografi

Tvådimensionell kromatografi representerar den mest grundliga och rigorösa metoden för utvärdering av proteomet . Medan tidigare accepterade tillvägagångssätt har använt kromatografiska tillvägagångssätt med elueringssätt, såsom katjonbyte till HPLC med omvänd fas, är utbytena typiskt mycket låga, vilket kräver analytisk känslighet i det pikomolära till femtomolära området. Eftersom undanträngningskromatografi erbjuder fördelen med koncentration av spårkomponenter, representerar tvådimensionell kromatografi som använder förskjutning snarare än elueringsläge i uppströmskromatografisteget ett potentiellt kraftfullt verktyg för analys av spårkomponenter, modifieringar och identifiering av mindre uttryckta komponenter i proteomen.