Translatomics
Translatomics är studiet av alla öppna läsramar (ORF) som aktivt översätts i en cell eller organism . Denna samling av ORF kallas translatom . Att karakterisera en cells translatom kan ge insikt i mängden av biologiska vägar som är aktiva i cellen. Enligt den centrala dogmen inom molekylärbiologin transkriberas DNA i en cell för att producera RNA , som sedan översätts för att producera ett protein . Tusentals proteiner är kodade i en organisms genom , och proteinerna som finns i en cell utför tillsammans många funktioner för att stödja cellens liv. Under olika förhållanden, såsom under stress eller specifika tidpunkter i utvecklingen, kan cellen kräva olika biologiska vägar för att vara aktiva och därför kräva en annan samling av proteiner. Beroende på inneboende och miljöförhållanden varierar samlingen av proteiner som görs samtidigt. Translatomiska tekniker kan användas för att ta en "snapshot" av denna samling av aktivt översättande ORF, som kan ge information om vilka biologiska vägar som cellen aktiverar under nuvarande förhållanden.
Vanligtvis används ribosomprofileringstekniken för att förvärva translatominformationen. Andra metoder är polysomprofilering , fullängdstranslaterande mRNA-profilering ( RNC-seq ) och translaterande ribosomaffinitetsrening (TRAP-seq). Till skillnad från transkriptomet är translatomen en mer exakt approximation för att uppskatta expressionsnivån för vissa gener , eftersom korrelationen mellan proteomen och translatomen är högre än korrelationen mellan transkriptomen och proteomen.
Historia
När det närmade sig slutförandet av Human Genome Project ändrade genetikområdet sitt fokus mot att bestämma geners funktioner. Detta innebar att katalogisera andra samlingar av biologiskt material, som RNA och proteiner i celler. Dessa samlingar av material kallades -omer, vilket framkallar den utbredda spänningen kring sekvenseringen av det mänskliga genomet. Termen translatome föreslogs först 2001 av Greenbaum et al. Translatomen var avsedd att beskriva de relativa mängderna proteiner i ett proteom . Termen translatom hänvisar nu generellt till samlingen av proteiner som aktivt skapas i en cell. Translatomics, i kombination med degradomics , syftar till att beskriva nettoförändringen av proteomet under olika förhållanden.
Relevans och bidrag till omics
Syftet med genomik är att studera genomet, eller insamlingen av genetiskt material i en organism. Genomikunderfält, eller andra omik , såsom Transcriptomics och proteomics syftar till att karakterisera genomets funktion genom att kvantifiera genomets produkter (som RNA och proteiner) under olika förhållanden. Genom att göra det får omics insikt i olika nivåer av reglering av genuttryck och därför genomfunktion. Dessa fält karaktäriserar dock biomolekyler som redan har bildats. I vissa fall reflekterar överflöd av RNA eller protein inte funktionen eftersom dessa biomolekyler kan brytas ned snabbt, eller så kan de finnas kvar i en cell långt efter att de initialt syntetiserats. När man använder proteomiktekniker för att studera proteomet kan reglering av proteinöverflöd på nivån av posttranslationell modifiering och proteinnedbrytning dölja tidigare regulatoriska processer. Eftersom cellulära funktioner ofta regleras på translationsnivå, vilket betyder att transkriptomet inte alltid återspeglar genomets funktion, kan användning av translatomiska tekniker för att studera translatomen tillåta en att observera reglering av genomets funktion som skulle skymmas i transkriptomik eller proteomikstudier.
Metoder
Översätta mRNA Messenger RNA
De flesta translatomiska tekniker fokuserar på att karakterisera de mRNA som är komplexbundna med ribosomer och därför översätts.
Polysomprofilering
Polysomprofilering är en teknik som används för att karakterisera graden av translation av en eller flera mRNA. Ett mycket översatt mRNA existerar som en polysom , vilket betyder att det är komplexbundet med flera ribosomer. mRNA som translaterats vid lägre nivåer är komplexbundna med färre ribosomer. Vid polysomprofilering används en sackarosgradient för att separera molekylära komplex i ett cellysat baserat på storlek. Fraktionerna från kolonnen analyseras genom sekvensering eller andra metoder. Translationshastigheten för mRNA bestäms baserat på dess detektion och förekomst i fraktionerna med lägre och högre molekylvikt.
RNC-seq
Fullängdstranslaterande mRNA (RNC-seq) involverar centrifugering av lyserat prov på en sackaroskudde. Detta möjliggör separation av ribosom-nascent chain complex (RNC) från fria mRNA och andra cellkomponenter. RNC:erna bildar en pellet i centrifugeringen som samlas in för vidare analys. Det mRNA som translateras i dessa RNC kan sekvenseras, vilket möjliggör identifiering och kvantifiering av de mRNA som translateras vid den tidpunkten. RNC-mRNA-komplex är emellertid ömtåliga vilket kan leda till att ribosomer dissocierar från mRNA och nedbrytning av mRNA, vilket potentiellt kan påverka de insamlade resultaten.
Ribo-seq/Ribosome profiling/Ribosome footprinting
Vid ribosomprofilering utsätts cellulärt mRNA inklusive polysomer för ribonukleaser, enzymer som klyver RNA. De positioner i RNA-molekylerna som är bundna av ribosomer är skyddade mot matsmältning. Efter upphörande av ribonukleasaktivitet kan dessa skyddade platser återvinnas och sekvenseras. Sekvenserna erhållna från ribo-seq representerar därför fragment av mRNA som aktivt translaterades.
TRAP-seq
TRAP-seq används för att identifiera mRNA som aktivt översätts i en specifik celltyp inom en vävnad eller ett annat sortiment av celler. Celltypen av intresse är konstruerad för att uttrycka en ribosomal subenhet fusionerad till en epitoptagg såsom grönt fluorescerande protein . Efter cellysering används antikroppar som riktar sig mot epitopen för att isolera mRNA som är bundna till ribosomerna som innehåller fusionsproteinerna. Detta RNA omvandlas sedan till cDNA och sekvenseras. Denna teknik identifierar specifikt mRNA som översattes i celltypen av intresse.
Nya polypeptider
Fällbara stater
Masspektrometri
Masspektrometrimetoder kan inte bestämma veckning av nyblivna polypeptider . Inga aktuella metoder undersöker veckningstillstånden hos begynnande polypeptider globalt i cellen. Det finns metoder för att undersöka veckningstillståndet för individuella begynnande polypeptider.
En metod använder ett ospecifikt proteas för att klyva den begynnande peptiden vid låg temperatur. Proteaset kan klyva de ovikta, flexibla områdena, men kan inte skära hårt vikta områden. Produkterna från klyvningen kan sedan separeras och studeras för att bestämma de veckade regionerna av den begynnande peptiden.
Nukleär magnetisk resonans
För att analysera hela strukturen av en nybildad polypeptid används kärnmagnetisk resonans (NMR) . NMR tillåter en dynamisk bild av molekyler i lösning och kan därför användas på ribosom-nascent chain complexes (RNC) . Märkning av ribosomer gör att NMR-data kan filtreras för misstänkt ribosomsignal och identifiera signalen för den begynnande polypeptiden.
Identifiering och kvantifiering
Även om strukturen hos nystartade polypeptider för närvarande inte kan undersökas i global skala, är det inte identifiering och kvantifiering.
Stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur
En metod använder en variant av stabil isotopmärkning med aminosyror i cellkultur (SILAC). SILAC märker proteiner med stabila isotoper för att möjliggöra kvantifiering, jämföra märkta och omärkta peptider för kvantifiering. Pulse SILAC (pSILAC), tillåter endast att peptider som skapas under pulsen märks. I teorin tillåter detta en infångning av endast begynnande peptider för kvantifiering. SILAC kräver emellertid liknande nivåer av märkta och omärkta proteiner för korrekt kvantifiering. Som sådan måste pSILAC-pulser löpa mycket längre än translationsprocessen, vilket gör kvantifieringen av begynnande peptider inexakt.
Bio-ortogonal/kvantitativ icke-kanonisk aminosyramärkning
Bio-ortogonal/kvantitativ icke-kanonisk aminosyramärkning (BONCAT/QuaNCAT) använder azidohomoalanin (AHA) för att märka proteiner. Detta möjliggör isolering av nyskapade proteiner för MS. Användning av AHA kräver dock utarmning av intracellulärt metionin och införande av AHA, vilket stressar cellen och potentiellt förändrar translationsdynamiken inuti. I likhet med pSILAC kräver AHA-metoder längre pulser, vilket begränsar dess effektivitet vid kvantifiering av begynnande peptider.
Puromycin-associerad begynnande kedja av proteomik
Puromycin-associerad nascent chain proteomics (PUNCH-P) använder en puromycin-biotin-märkning för att fånga upp begynnande polypeptider för MS. Även om det inte stör cellprocessen, är det mindre känsligt än andra metoder för att upptäcka begynnande peptider. Utöver dessa kvantifieringsmetoder arbetar man med andra MS-baserade metoder.
mRNA-nedbrytning
Nedbrytning av mRNA spelar också en viktig roll för att reglera translationsprocessen.
För att utforska mekanismer för sönderfall, genomomfattande kartläggning av oavslutade och kluvna transkript (GMUCT), parallellanalys av RNA-ändar (PARE) och degradomsekvensering använder T4-ligas från Illumina-sekvenseringsplattformen för att sekvensera avkapslade mRNA. T4-ligas ligerar på RNA med ett fritt 5'-monofosfat. Eftersom mogna mRNA har en 5'-kapsel, binds de inte som substrat, vilket lämnar avkapslade och nedbrytande mRNA som kan bindas.
5'-monofosforylerade ändar sekvensering (5Pseq) fångar både kapslade och avkapslade sekvenser för att möjliggöra sekvensering av både moget mRNA och nedbrutna produkter. Detta hjälper till att identifiera mRNA-nedbrytningsprodukter och har användningsområden för att studera ribosomstopp.
Dessa metoder studerar 5' till 3'-nedbrytning, miRNA -medierad klyvning och nonsens-medierad mRNA-nedbrytning , men kan inte mäta 3' till 5'-nedbrytning och andra nedbrytningsmekanismer.
In vivo-översättningsspårning
Teknikerna ovan kräver lysering av celler och kan därför inte utföras i levande celler. En molekyl fluorescensresonansenergiöverföring (smFRET) och Nascent chain tracking (NCT) använder fluorescens för att spåra translationell aktivitet. Båda metoderna spårar förlängningshastigheter för polypeptiderna på enstaka mRNA. Ingen av teknikerna är dock kapabel till hög genomströmning.
tRNAome
Transfer RNA (tRNA) är en viktig del av Translation . tRNA:n läser av mRNA:n, vilket leder till aminosyrorna som ribosomen sätter ihop till en polypeptid. Som sådan har överflöd och typer av tRNA en stor effekt på hastigheten för proteinsyntes. tRNA kan vara mycket lika andra tRNA, med vissa tRNA-arter som bara skiljer sig åt med en enda nukleotid. Detta i kombination med liknande sekundära och tertiära strukturer gör det svårt att separera olika tRNA-arter.
Gelelektrofores
2D-Gel elektrofores är en klassisk metod som används för att separera tRNA. Inledningsvis denatureras tRNA i 7M urea och separeras i den första geldimensionen. 4M urea tillåter partiell återveckning för ytterligare separation i den andra geldimensionen. Denna metod har möjliggjort separation i 48 uppsättningar i E. coli och 30 i B. subtilis men har begränsad upplösning. Ett stort antal olika tRNA-arter kan inte separeras helt med 2D-gelelektrofores, med endast 62 fläckar som hittas för de 269 rått-tRNA:erna.
Vätskekromatografi
Högpresterande vätskekromatografi kan användas för att separera tRNA baserat på aminoacylerade tRNA-isoacceptorer. Denna metod kan inte helt separera tRNA-arterna och kan inte skilja mellan kodoner, även om den fortfarande kan hitta kvantitativa skillnader mellan olika cellinjer.
Masspektrometri
Masspektrometri (MS) kan användas för att separera tRNA baserat på unika endonukleasspjälkningsprodukter. Detta har dock begränsad upplösning med blandningar av 30 tRNA-arter och behöver fraktionering före MS i större grupper av tRNA. Det kan inte heller användas för att identifiera deNovo tRNA-arter eftersom det kräver förkunskaper om matsmältningsmönstren för tRNA-arter.
Mikroarrayer
Hybridiseringsbaserade mikroarrayer använder den 3'CCA-konserverade sekvensen i tRNA för att fästa en fluorescerande sond. 70-80 nukleotider långa prober, som täcker längden av tRNA, används sedan för att binda tRNA. tRNA med minst 8 basskillnader kan särskiljas med mikroarrayer, men tRNA med mindre skillnader binder till samma sond.
Kvantitativ omvänd transkription
Kvantitativ omvänd transkription, realtids-PCR (qRT-PCR) är ett annat sätt att identifiera och kvantifiera tRNAomet. En primer för den konserverade 3'CCA-sekvensen används för att prima omvänd transkription för alla tRNA-arter. Kraftig modifiering av tRNA-nukleotiderna och stabiliteten hos tRNA-molekylen kan vara ett problem, så höga temperaturer och demetylering har använts för att motverka dessa. Demetylering har också använts för att motverka fel som kraftig metylering inducerar vid sekvensering.
Ribo-seq liknande
Ribo-tRNA-seq har utvecklats för att observera rollen av tRNA närmare translation. I likhet med Ribo-seq, fångar Ribo-tRNA-seq tRNA-molekyler i ribosomer för biblioteksberedning före sekvensering