Polysomprofilering
Polysomprofilering är en teknik inom molekylärbiologi som används för att studera sambandet mellan mRNA och ribosomer . Det är viktigt att notera att denna teknik skiljer sig från ribosomprofilering . Båda teknikerna har granskats och båda används i analys av translatomen , men data de genererar är på mycket olika specificitetsnivåer. När den används av experter är tekniken anmärkningsvärt reproducerbar: de 3 profilerna i den första bilden är från 3 olika experiment.
Proceduren
Proceduren börjar med att göra ett cellysat av cellerna av intresse. Detta lysat innehåller polysomer , monosomer (som består av en ribosom som finns på ett mRNA ), de små (40S i eukaryoter ) och stora (60S i eukaryoter) ribosomala subenheter, "fritt" mRNA och en mängd andra lösliga cellulära komponenter.
Proceduren fortsätter genom att göra en kontinuerlig sackarosgradient med kontinuerligt variabel densitet i ett centrifugrör . Vid de använda koncentrationerna (15-45 % i exemplet) stör sackaros inte associationen av ribosomer och mRNA. 15 %-delen av gradienten är överst på röret, medan 45 %-delen är längst ner på grund av deras olika densitet .
En specifik mängd (mätt med optisk densitet ) av lysatet läggs sedan försiktigt ovanpå gradienten i röret. Lysatet, även om det innehåller en stor mängd lösligt material, är mycket mindre tätt än 15 % sackaros, och det kan därför hållas som ett separat lager på toppen av röret om detta görs försiktigt.
För att separera komponenterna i lysatet utsätts preparatet för centrifugering. Detta accelererar komponenterna i lysatet med många gånger tyngdkraften och driver dem på så sätt genom gradienten baserat på hur "stora" de enskilda komponenterna är. De små (40S) underenheterna färdas mindre långt in i gradienten än de stora (60S) underenheterna. 80S-ribsomerna på ett mRNA färdas vidare (observera att bidraget från mRNA:ts storlek till den tillryggalagda sträckan inte är signifikant). Polysomer som består av 2 ribsomer färdas längre, polysomer med 3 ribsomer färdas ännu längre, och vidare och vidare. Komponenternas "storlek" anges av S, svedbergsenheten . Observera att ett S = 10 −13 sekunder, och att begreppet "stor" faktiskt är en överförenkling.
Efter centrifugering samlas innehållet i röret upp som fraktioner från toppen (mindre, långsammare) till botten (större, snabbare) och den optiska densiteten för fraktionerna bestäms. De första fraktionerna som tas bort har en stor mängd relativt små molekyler, såsom tRNA, enskilda proteiner, etc.
Ansökningar
Det är möjligt att använda denna teknik för att studera den övergripande graden av translation i celler (till exempel), men den kan användas mycket mer specifikt för att studera enskilda proteiner och deras mRNA. Som ett exempel som visas i den nedre delen av figuren kan ett protein som utgör en del av den lilla subenheten först detekteras i 40S-fraktionen, försvinner sedan nästan från 60S-fraktionen (separationerna på dessa gradienter är inte absoluta), och dyker sedan upp igen. i 80S och polysomfraktioner. Detta indikerar att det som mest finns väldigt lite av proteinet som finns i cellen som inte är en del av den lilla subenheten. I motsats härtill, i den övre raden av immunoblotfiguren, uppträder ett lösligt protein i de lösliga fraktionerna och associerat med ribosomer och polysomer. Det speciella proteinet är ett chaperoneprotein , som (i korthet) hjälper till att vika den begynnande peptiden när den extruderas från ribosomen. Som annat arbete
i den visade tidningen finns det en direkt associering av chaperonen med ribosomen.
Tekniken kan också användas för att studera graden av translation av ett visst mRNA. I dessa experiment undersöktes 5'- och 3'-sekvenser av ett mRNA för deras effekter på mängden producerat mRNA och hur väl mRNA:n translaterades. Som visas translateras inte alla mRNA-isoformer med samma effektivitet även om deras kodande sekvenser är desamma.