Degradomics
Degradomics är en underdisciplin av biologi som omfattar alla genomiska och proteomiska tillvägagångssätt som ägnas åt studiet av proteaser , deras inhibitorer och deras substrat i en systemomfattande skala. Detta inkluderar analysen av proteas- och proteas-substratrepertoarerna, även kallade "proteasdegradomer". Omfattningen av dessa degradomer kan variera från cell- , vävnads- och organismomfattande skalor.
Bakgrund
Som den näst största klassen av enzymer bakom ubiquitinligaser och ansvariga för ~2% av alla organismers gener, har proteaser uppmärksammat biologer för att utveckla ett område som syftar till att identifiera och kvantifiera deras roller inom biologi. Degradomics, som myntades första gången 2000 av Overall Lab i McQuibban et al., beskrevs som att länka proteaser till substrat på proteombasis. Upptäckten av nya roller för proteaser och genombrott i proteas-substratupptäckten skulle senare sammanfattas av Dr. Carlos Lopez-Otin och Dr. Chris Overall, som introducerar degradomics i en systemomfattande skala. De sammanställde nuvarande och framväxande tekniker tillgängliga för att beskriva proteolys. Genom att uppmärksamma hur proteolys fungerar som en ytterligare irreversibel mekanism genom vilken celler kan uppnå kontroll över biologiska processer, beskrev de nödvändigheten av att studera proteaser för deras funktionella relevans vid bearbetning av bioaktiva molekyler. Dessa bioaktiva molekyler spelar roller i koagulation, komplementaktivering, DNA-replikation, cellcykelkontroll, cellulär proliferation och migration, hemostas, immunitet och apoptos. Degradomet bröts ner i två begrepp, det första avser hela profilen av proteaser som uttrycks under av en cell, vävnad eller organism under definierade omständigheter. Den andra definitionen gäller specifikt för hela substratrepertoaren för ett visst proteas i en cell, vävnad eller organism.
Dr. Overalls grupp skulle fortsätta med att kommentera de fullständiga degradomerna av proteashämmare från människa och mus under 2003. När komplexiteten hos proteolytiska nätverk avslöjades, blev mer grundliga beskrivningar av degradomen och sätt att studera den nödvändiga. Under 2007 uppdaterade Dr. Overall fältet med en recension medförfattare av Dr. Carl Blobel som beskriver hur avancerade metoder revolutionerade upptäckten av proteassubstrat. De beskrev processen att länka proteaser till deras substrat i en steg-för-steg-process, som började med biokemiska och proteomiska upptäckter, validering med hjälp av cellbaserade analyser och framsteg till hela organismnivåer med hjälp av djurmodeller. På senare tid, allt eftersom teknologin och teknikerna har utvecklats, har Overall Lab och andra fortsatt att styra fältet med hjälp av mer kraftfulla och kvantitativa tekniker.
Metoder
Transkriptomiska metoder
Gene Microarrays
Traditionellt använder DNA-mikroarrayer komplementära DNA- eller oligonukleotidsonder för att analysera budbärar-RNA (mRNA) från gener av intresse. Extraherat totalt RNA fungerar som en mall för komplementärt DNA (cDNA) som är märkt med fluorescerande prober innan det får hybridisera till mikroarrayen för visualisering. För proteaser har specifika prober för proteasgener och deras inhibitorer utvecklats för att se uttrycksmönster på mRNA-transkriptnivå. De två plattformar som för närvarande är tillgängliga för detta ändamål kommer från företag och akademiska källor. Affymetrix Hu/Mu ProtIn Microarray använder 516 och 456 probuppsättningar för att utvärdera humana respektive murina proteaser, inhibitorer och interaktorer. CLIP-CHIP™, utvecklat av Overall Lab, är en komplett proteas- och inhibitor-DNA-mikroarray för alla 1561 humana och murina proteaser, icke-proteolytiska homologer och deras inhibitorer. Båda dessa verktyg möjliggör jämförelse av uttrycksmönster mellan normala och sjuka prover och vävnader. Tyvärr, eftersom transkriptnivåer ofta misslyckas med att reflektera proteinuttrycksnivåer, är genmikroarrayer begränsade när det gäller att representera protein i prover. Dessutom ignoreras proteaser som rekryterats från avlägsna källor som närliggande vävnader av dessa DNA-baserade arrayer, vilket upprepar behovet av proteinbaserade metoder för att bekräfta närvaron och aktiviteten av funktionella enzymer när transkriptomanalys utförs.
Kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (qRT-PCR)
Ett mer känsligt tillvägagångssätt för transkriptanalys av en gen är kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (qRT-PCR), som också har sett verkan vid kvantifiering av proteas-mRNA-nivåer. Återigen extraheras totalt RNA och används för att generera cDNA för PCR-amplifiering. Så länge det finns en specifik primer för ett proteas, en proteashämmare eller en interagerande molekyl, kan qRT-PCR fungera som en mycket känslig metod för att detektera små mängder mRNA-kopiatal per cell. En nackdel som skiljer den från mikroarrayanalys är dess begränsade omfattning: en mikroarray kan hantera parallell analys av flera gener medan qRT-PCR måste amplifiera ett mRNA för analys åt gången. Den lider också av samma begränsning av mikroarrayanalys när det gäller bristen på korrelation mellan transkript och proteinnivåer. Emellertid ger dess känslighet det som ett användbart verktyg för att validera mikroarrayfynd och kvantifiera specifika proteas-transkript av intresse.
RNA-sekvensering (RNA-seq)
Whole transcriptome shotgun sequencing (WTSS) är det senaste inom genuttrycksstudier, med hjälp av nästa generations sekvensering (NGS) för att kvantifiera RNA i prover på en skala med hög genomströmning. När biologin går mot att använda RNA-seq över mikroarrayanalys för att utvärdera transkriptomet, så gör degradomics det. Fältet anpassar tillvägagångssättet för att analysera närvaron och kvantiteten av transkript av proteaser, deras substrat och deras inhibitorer. Medan utvecklade mikromatriser förblir en viktig arbetshäst för att studera genuttryck i degradomics, tyder dess begränsningar av korshybridisering och dynamiskt områdesproblem att RNA-seq kommer att ta en större roll när kostnaderna minskar och analysen förbättras.
Genomiska metoder
Jäst två-hybrid skärmar
Jäst två-hybrid analyser har anpassats för proteas-substrat upptäckt. Eftersom proteasexositer spelar roller i protein-proteinigenkänning och interaktion, har biologer använt exositer som verktyg för att screena för proteasinteraktörer och potentiella substrat. Dessa proteasexositavsökningsanalyser använder proteasexositer som bete för att skanna ett cDNA-bibliotek efter möjliga interagerande partners.
En annan tidig anpassning av tvåhybridscreening av jäst vid upptäckt av proteassubstrat är Inactive-catalytic-domain capture (ICDC). Detta tillvägagångssätt försöker undvika begränsningen av proteasexositskanning, som inte tar hänsyn till några substrat som inte kräver exositer för igenkänning före klyvning. Betet för dessa analyser är immobiliserade katalytiskt inaktiva muterade proteasdomäner som inte kan klyva och frigöra sina substrat när de väl är bundna.
Även om de är användbara i tidiga degradomiska studier, har begränsningarna hos anpassade tvåhybridskärmar av jäst tvingat fältet att gå vidare till metoder med högre genomströmning för upptäckt av proteassubstrat. Deras höga frekvens av falska positiva och negativa, oförmåga att känna igen komplexa interaktioner, avsaknad av biologisk uppdelning och underlåtenhet att ta hänsyn till post-translationella modifieringar som är nödvändiga för protein-protein-interaktioner hämmar deras användbarhet. Således har de till stor del ersatts av proteomiska metoder i takt med att tekniken har förbättrats.
Proteomiska metoder
Proteasspecifika matriser
En proteasspecifik proteinuppsättning baserad på immobiliserade antikroppar utformade för att fånga specifika proteaser från biologiska prover erbjuder ett steg upp i analys av proteinnivåer bortom transkriptuttryck. Infångningsantikroppar som är fläckiga mot nitrocellulosamembran kan binda proteaser i komplexa blandningar som har förinkuberats och bundits av detektionsantikroppar, vilket möjliggör parallell analys av relativa proteasnivåer. Dessa arrayer erbjuder parallellisering av proteinnivåer jämfört med traditionell western blot. Tyvärr ger dessa analyser inte insikt om enzymatisk funktion för proteaser och lider av liknande nackdelar som western blöts vad gäller tillförlitlig kvantifiering.
Immunhistokemi tillvägagångssätt
Som en antikroppsteknik möjliggör immunhistokemi (IHC) validering av proteinnärvaro. Det, och immuncytokemi, gör det möjligt att kartlägga lokaliseringen av proteaser på vävnads- respektive cellulär skala. Den kan också utvärdera för lokalisering av klyvningsprodukter med användning av monoklonala antikroppar framtagna mot neo-epitoper av klyvningsställen producerade genom proteasbearbetning. Tyvärr, förutom att tillhandahålla lite funktionell information, är IHC också icke-kvantitativ, vilket gör det till ett oattraktivt alternativ för att beskriva degradomics på systemomfattande skalor.
Gelbaserade proteomiska metoder
Tvådimensionell polyakrylamidelektrofores (2D-PAGE) geler jämförde historiskt intensiteter från proteasbehandlade och obehandlade provfläckar för att identifiera möjliga kandidatsubstrat. En nyare förbättring av denna teknik, fluorescerande 2D-differensgelelektrofores (2D-DIGE), försöker kontrollera standardisering mellan geler för relativ kvantifiering. Differentiell märkning av proteasbehandlade och obehandlade prover med antingen Cy3 eller Cy5, sammanslagning av nämnda prover och analys av dem tillsammans med 2D-PAGE tillåter att substrat och klyvningsprodukter studeras från den fluorescerande gelén. De fläckar som motsvarar potentiellt substrat- och klyvningsprodukter kan senare belysas med användning av masspektrometri eller Edman-sekvensering. De största nackdelarna med att använda dessa tekniker relaterar till själva teknikens kemi och dess brist på känslighet. Eftersom de förlitar sig på PAGE-geler kommer extremt stora, små, mycket hydrofoba, sura eller basiska molekyler inte att visualiseras.
Masspektrometribaserade proteomiska metoder
Konventionell proteomikidentifiering av hagelgevär av proteiner med låg förekomst i prover är fortfarande begränsad trots framsteg inom masspektrometri (MS)-teknologi. Även om rikliga proteiner lätt kan detekteras, kan möjliga proteassubstrat av biologisk betydelse, såsom cytokiner, lätt förbises på grund av deras låga förekomst. De flesta förclearingstrategier utformade för att korrigera detta riskerar också att förlora proteiner med låg mängd proteiner, så tekniker som utformats specifikt för att rikta proteassubstrat för identifiering har utvecklats. Dessa tekniker har smält samman till ett nytt område av positionell proteomik eller terminomi som syftar till att identifiera protein N- eller C-terminala modifieringar av proteassubstrat. Terminomiska tillvägagångssätt inklusive terminal aminisotopmärkning av substrat (TAILS) N-terminomics, Combined FRActional Diagonal Chromatography (COFRADIC) och C-Terminomics tillför den stringens nivån till konventionell hagelgevärsproteomik som är nödvändig för att göra dem till degradomics arbetshäst.
TAILS, eller "N-Terminomics", designades och utvecklades av Overall Lab för att övervinna de funktionella begränsningarna hos konventionell proteomik genom att berika både mogna N-terminala peptider och nygenererade N-terminala peptider av proteiner producerade av proteasaktivitet. Formaldehyd eller isobariska taggar inklusive isotopkodade affinitetstaggar (ICAT), 4 till 8 plex isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering (iTRAQ), eller 10plex Tandem mass tags (TMT) blockerar primära aminer före trypsindigestion av proteomprover. Huvudsteget i processen är det negativa urvalet av nygenererade trypsinpeptider med hjälp av en specialiserad polymer. Polymeren ignorerar de oreaktiva primära aminerna som blockeras av deras taggar, vilket gör att de kan separeras från trypsingenererade peptider genom ultrafiltrering för vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS/MS) analys. Dessa mogna och neo-N-terminaler kommer att skilja sig i förhållandet mellan de proteasbehandlade och obehandlade proverna och utgöra det proteolytiska fingeravtrycket för ett proteas. TAILS är också kompatibel med stabil isotopmärkning av aminosyror i cellkultur (SILAC).
COFRADIC var den tidigaste tekniken för att utnyttja negativ selektion för att berika protein N-termini. Provproteiner blockeras först genom reduktion och alkylering vid deras primära aminer före endopeptidasbehandling. Dess negativa selektionsmetod bygger på stark katjonbyteskromatografi (SCX) för att berika för peptider som representerar N- och C-terminaler av proteiner baserat på skillnader i peptidladdning och pH. Ytterligare ortogonala kromatografibehandlingar förändrar peptidernas biokemiska karaktär för ytterligare anrikning innan slutlig LC-MS/MS-analys. Grupper har fortsatt att anpassa och förbättra denna teknologi för upptäckt av proteassubstrat.
C-terminomik har alltid varit komplicerad på grund av den kemiska naturen hos dess mål. Karboxylgrupper är mindre reaktiva än primära aminer, vilket gör C-terminomiska tekniker mer komplexa än etablerade N-terminomiska metoder. Däremot har anpassade TAILS- och COFRADIC-arbetsflöden utvecklats specifikt för att studera proteiners C-termini. Nyligen tacklade Overall Lab en annan svårighet med C-terminomik, genom att använda endopeptidas LysargiNase™ för att generera C-terminaler som bär N-terminala lysin- eller argininrester. Tidigare saknade C-termini basiska rester efter endopeptidasdigestion och kunde missas i LC-MS/MS-arbetsflöden.
Ett annat tillvägagångssätt utformat för att ytterligare belysa proteasaktivitet är proteomisk identifiering av proteasklyvningsställen (PICS). Med utgångspunkt i ett peptidbibliotek genererat från endopeptidasspjälkning av ett proteom, möjliggör denna teknik screening och karakterisering av prime- och icke-primespecificiteten för proteaser. Efter digestion blockeras primära aminer och sulfhydryl kemiskt innan provet smälts igen med önskat proteas. Nu kan proteasgenererade primära aminer som utgör det främsta stället för klyvning biotinyleras och isoleras på grund av deras reaktivitet och analyseras med LC-MS/MS. Icke-prima sidosekvenser som lämnas kvar måste bestämmas med hjälp av bioinformatisk analys av de extraherade N-termini och fullängdsproteinsekvenserna. Dessa primära och icke-primära ställen ger en fullständig bild av proteasklyvningsställets specificitet.
Aktivitetsbaserad profilering
För att uppnå funktionell degradomi måste den enzymatiska aktiviteten hos proteaser analyseras. Metoder har utvecklats för att särskilja den proteolytiska aktiviteten hos olika enzymer i biologiska prover och separera aktiva proteaser från deras inaktiva former, nämligen zymogenprekursorer och de proteaser som är bundna av inhibitorer. Två tekniker är aktivitetsbaserade prober (ABPs) och Proteolytic Signature Peptides (PSPs).
ABP-molekyler fungerar som sönder för att irreversibelt binda endast till aktiva proteaser och ignorera deras zymogenprekursorer och inhiberade proteaser. Att placera en reaktiv grupp och en igenkännbar märkningsfunktion på samma molekyl med hjälp av en länkdel ger en ABP-molekyl dess struktur. Den reaktiva molekylen, designad efter proteashämmarmekanismer, ger ABP sin specificitet mot att rikta in sig på aktiva proteaser. När den väl är bunden fungerar den reaktiva gruppen ungefär som en irreversibel inhibitor för proteaset. Beroende på typen av taggen kan ABP-proteaskomplexet sedan visualiseras eller hämtas från biologiska prover för ytterligare studier av lokalisering och kvantifiering. Begränsningar inklusive svår produktion, specificitet, stabilitet och toxicitet hämmar utvecklingen av ABP men dessa sonder har visat sig användbara för att avslöja biologisk proteasaktivitet och förblir en lovande väg inom degradomisk teknologi.
PSP:er är inte beroende av att rikta in sig på aktiva proteaser med taggade föreningar utan snarare på kvantitativ proteomik som använder stabila isotopmärkta standardpeptider. Standardpeptider syntetiserade från aminosyror märkta med stabila isotopatomer fungerar som interna standarder för serieutspädningar av ett prov. Dessa möjliggör senare absolut kvantifiering av proteiner och posttranslationella modifieringar genom masspektrometri. Denna teknik har anpassats till absolut kvantifiering av proteaser, och dechiffrerar både aktivitetstillstånd och totala mängder i biologiska prover. Detta är tack vare trypsinbehandling för masspektrometri som genererar peptider som är specifika för inaktiva zymogenprekursorer, aktiva proteaser eller gemensamma för båda formerna. PSPs är en form av standardpeptid för absolut kvantifiering och Standard of the Expressed Protease (STEP) är den andra. Den största skillnaden mellan de två är att PSP-sekvenser är utformade för att efterlikna tryptiska peptider som innehåller sekvenser som spänner över zymogens pro-domän och proteasets slutliga form, medan STEP-sekvenser matchar tryptiska peptidsekvenser som finns i båda formerna av proteaset. Detta utnyttjar proteasaktivering, där zymogenens pro-domän klyvs av och den slutliga formen saknar den domänen. Experiment med iTRAQ-märkning och LC-MS/MS med STEP- och PSP-peptidinterna standarder har framgångsrikt kvantifierat totala och aktiva proteasnivåer i biologiska prover. En stor nackdel med detta tillvägagångssätt är oförmågan att ta hänsyn till inhibitorbundna enzymer. Det är också svårt att säkerställa att standardpeptider kan genereras för denna metod för varje proteas för studier.
Experiment med iTRAQ-märkning och LC-MS/MS med STEP- och PSP-peptidinterna standarder har framgångsrikt kvantifierat totala och aktiva proteasnivåer i biologiska prover. En stor nackdel med detta tillvägagångssätt är oförmågan att ta hänsyn till inhibitorbundna enzymer. Det är också svårt att säkerställa att standardpeptider kan genereras för denna metod för varje proteas för studier. PSP:er har dock stor potential för att översätta degradomics till kliniska tillämpningar, eftersom när en PSP väl har etablerats kan den hjälpa till att kvantifiera proteolytiska signaturbiomarkörer i kliniska analyser av typen Single Reaction Monitoring (SRM) och Multiple Reaction Monitoring (MRM).
Bioinformatik
På grund av den ökande komplexiteten i regleringen av cellulära processer och de roller proteaser spelar i dem, fortsätter bioinformatik att vara ett ovärderligt verktyg för degradomik. Programvara, databaser och projekt som utvecklats för detta ändamål har följt med teknikens framsteg. Programvara utvecklad i Overall Lab (CLIPPER) utvärderar statistiskt kandidater för klyvningsställen bestämt av degradomiska metoder. En webbaserad datasajt, WebPICS, innehåller och integrerar klyvningsplatsanalys från PICS-experiment i MEROPS, proteasdatabasen. En annan databas, Termini oriented protein Function Inferred Database (TopFIND), fungerar som en kunskapsbas för att integrera proteintermini som bildas av proteasbearbetning med funktionella tolkningar. Genom att kombinera forskningslitteratur och andra biologiska databaser inklusive UniProt, MEROPS, Ensembl och TisDB, gör databasen heltäckande modifieringar av proteintermini tillgängliga för ett brett forskarsamhälle. Med hjälp av TopFIND kan terminala modifieringar identifieras och visualiseras över proteiner tack vare alla tillgängliga i silico, in vitro och in vivo fynd. Med hjälp av programvaran TopFINDer och Path FINDer kan forskningsresultat matematiskt modelleras till ett nätverk av vägar som regleras av proteaser, vilket ytterligare bidrar till "proteaswebben".
Betydelse och inverkan
Proteasbiologi
Tack vare snabba framsteg inom proteomik, genomik och bioinformatik har proteasforskningen revolutionerats. Degradomics uppstod med konceptet att proteolys representerar en specifik mekanism för att uppnå cellulär kontroll över vitala processer bortom kontroll som ges av genuttryck och translation och fortsätter att producera den forskning som krävs för att förstå den komplexa regleringen av biologi. Där man trodde att extracellulära proteaser bryter ned extracellulär matris (ECM), är dessa proteaser nu kända för att rikta in sig på och bearbeta ett stort antal substrat med olika roller, vilket omdefinierar proteasfunktioner och leder till en förändring i intresse mot nya roller som tidigare var okända för biologin. Degradomiska studier av mänsklig vävnad har också bidragit till Human Proteome Project (HPP) från Human Proteome Organization (HUPO).
Precisionsmedicin
Den proteasmodulerande webben representerar möjligheter att identifiera nya biomarkörer för sjukdomar och mål för läkemedelsdesign. Proteolytiskt bearbetade N-terminaler har föreslagits som potentiella biomarkörer eftersom sjukdomsspecifik proteolys har studerats väl i patologier som inflammation och cancer. Bidrag till degradomics har identifierat många karakteriserade och nya proteassubstrat och fortsätter att leda till spekulationer om tidigare okända proteasmål. På senare tid har proteolytiska signaturer av celldöd hittats med användning av N-terminomiska tekniker på plasmaprover från kemoterapipatienter. Framsteg i kliniska SRM- och MRM-analyser möjliggör också analys av proteolytiska signaturbiomarkörer i patientprover och kan kompletteras med PSP-kvantifiering. Att dechiffrera dessa nätverk kommer att hjälpa drogdesignen att förstå vilka substrat som har användbara roller jämfört med skadliga för att avgöra vilka som bör riktas mot droger.