Ribosomprofilering
Ribosomprofilering , eller Ribo-Seq (även kallad ribosomfootprinting ), är en anpassning av en teknik utvecklad av Joan Steitz och Marilyn Kozak för nästan 50 år sedan som Nicholas Ingolia och Jonathan Weissman anpassade för att fungera med nästa generations sekvensering som använder specialiserat budbärar-RNA ( mRNA ) sekvensering för att bestämma vilka mRNA som aktivt översätts . En relaterad teknik som också kan användas för att fastställa vilka mRNA som aktivt översätts är metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP), som utvecklades av Nathaniel Heintz vid Rockefeller University ( i samarbete med Paul Greengard och Myriam Heiman). TRAP involverar inte ribosomavtryck utan ger celltypsspecifik information.
Beskrivning
Den producerar en "global ögonblicksbild" av alla ribosomer som aktivt översätter i en cell vid ett visst ögonblick, känd som en translatom . Följaktligen gör detta det möjligt för forskare att identifiera platsen för translationsstartställen , komplementet av översatta ORFs i en cell eller vävnad, fördelningen av ribosomer på ett budbärar-RNA och hastigheten för att översätta ribosomer. Ribosomprofilering riktar sig endast mot mRNA-sekvenser som skyddas av ribosomen under processen för avkodning genom translation till skillnad från RNA-Seq , som sekvenserar allt mRNA från en given sekvens som finns i ett prov. Denna teknik skiljer sig också från polysomprofilering .
Historia
Ribosomprofilering är baserad på upptäckten att mRNA i en ribosom kan isoleras genom användning av nukleaser som bryter ned oskyddade mRNA-regioner. Denna teknik analyserar regionerna av mRNA som omvandlas till protein, såväl som nivåerna av translation av varje region för att ge insikt i globalt genuttryck. Före dess utveckling inkluderade ansträngningar för att mäta translation in vivo mikroarrayanalys på RNA isolerat från polysomer , såväl som translationell profilering genom affinitetsrening av epitopmärkta ribosomer. Dessa är användbara och kompletterande metoder, men ingen av dem tillåter den känslighet och positionsinformation som tillhandahålls av ribosomprofilering.
Används
Det finns tre huvudsakliga användningsområden för ribosomprofilering: identifiera översatta mRNA-regioner, observera hur begynnande peptider viks och mäta mängden specifika proteiner som syntetiseras.
Identifiera översatta mRNA-regioner
Genom att använda specifika läkemedel kan ribosomprofilering identifiera initierande regioner av mRNA, förlängningsregioner och områden med translationsstopp. Initierande regioner kan detekteras genom tillsats av harringtonin eller laktidomycin för att förhindra ytterligare initiering. Detta gör att startkodonet för mRNA genom hela cellysatet kan analyseras, vilket har använts för att bestämma icke-AUG-sekvenser som initierar translation . De andra förlängande regionerna kan detekteras genom att lägga till antibiotika som cykloheximid som hämmar translokation, kloramfenikol som hämmar överföring av peptider inom ribosomen eller icke-läkemedel som termisk frysning. Dessa töjningsfrysningsmetoder gör det möjligt att analysera translationens kinetik. Eftersom flera ribosomer kan översätta en enda mRNA-molekyl för att påskynda translationsprocessen, visar RiboSeq de proteinkodande regionerna i mRNA:t och hur snabbt detta görs beroende på mRNA:t som sekvenseras. Detta möjliggör också ribosomprofilering för att visa pausställen inom transkriptomen vid specifika kodon. Dessa platser med långsam eller pausad translation visas av en ökning av ribosomdensiteten och dessa pauser kan koppla specifika proteiner till deras roller i cellen.
Peptidvikning
Att koppla ribosomprofilering med ChIP kan belysa hur och när nysyntetiserade proteiner vikas. Med hjälp av fotspår som tillhandahålls av Ribo-Seq kan specifika ribosomer associerade med faktorer, som chaperoner, renas. Att pausa ribosomen vid specifika tidpunkter, låta den översätta en polypeptid över tiden, och exponera de olika punkterna för en chaperon och fälla ut med hjälp av ChIP renar dessa prover och kan visa vid vilken tidpunkt peptiden vikas.
Mätning av proteinsyntes
Ribo-Seq kan också användas för att uppskatta translationseffektivitet, en proxy för proteinsyntes. För denna applikation genereras ribosomprofilering och matchade RNA-sekvenseringsdata. De initiala dataanalyserna kan uppnås med dedikerade beräkningsramverk (ex.). Translationseffektivitet kan sedan beräknas som ribosombeläggningen av varje gen medan man kontrollerar för dess RNA-uttryck. Detta tillvägagångssätt kan kombineras med riktad störning av proteiner som binder till RNA och användning av ribosomprofilering för att mäta skillnaden i translation. Dessa störda mRNA kan associeras med proteiner, vars bindningsställen redan har kartlagts på RNA, för att indikera reglering.
Procedur
- Lysera cellerna eller vävnaden och isolera mRNA-molekylerna bundna till ribosomer.
- Immobilisera komplex. Detta utförs vanligtvis med cykloheximid men andra kemikalier kan användas. Det är också möjligt att avstå från translationshämmare med translationsinkompetenta lysförhållanden.
- Använd ribonukleaser för att smälta RNA:t som inte skyddas av ribosomer.
- Isolera mRNA-ribosomkomplexen med sackarosgradientdensitetscentrifugering eller specialiserade kromatografikolonner.
- Fenol / kloroformrening av blandning för att avlägsna proteiner.
- Välj storlek för tidigare skyddade mRNA-fragment.
- Ligera 3'-adapter till fragment.
- Subtrahera kända rRNA-föroreningar (valfritt).
- Omvänd transkription av RNA till cDNA med användning av omvänt transkriptas .
- Amplifiera på strängspecifikt sätt.
- Sekvens läser.
- Justera sekvensresultat till genomisk sekvens för att bestämma translationsprofil.
Material
- RNA-ribosomkomplex
- Cykloheximid
- Nukleaser
- Fenol/kloroform
- Omvänt transkriptas
- dNTP:er
- Sekvenseringsmetod -cDNA-bibliotek.