Spermiesortering
Spermiesortering är ett sätt att välja vilken typ av spermiecell som ska befrukta äggcellen . Flera konventionella tekniker för centrifugering eller simning . Nytillämpade metoder som flödescytometri utökar möjligheterna till spermiesortering och nya tekniker för spermiesortering utvecklas.
Det kan användas för att sortera ut spermier som är mest friska, såväl som för att bestämma mer specifika egenskaper, såsom könsval där spermier separeras i X- (kvinnliga) och Y- (manliga) kromosombärande populationer baserat på deras skillnad i DNA-innehåll. De resulterande "könssorterade" spermierna kan sedan användas tillsammans med andra assisterade befruktningsteknologier såsom konstgjord insemination eller in vitro fertilisering (IVF) för att producera avkomma av det önskade könet - hos lantbruksdjur men också i mänsklig medicinsk praxis .
Metoder
Konventionella tekniker
Flera metoder har använts för att sortera spermier före tillkomsten av flödescytometri. Densitetsgradientcentrifugering (i en kontinuerlig eller diskontinuerlig gradient) kan koncentrera spermaprover med låg koncentration av spermier, genom att använda tätheten av spermier som ett mått på deras kvalitet. På liknande sätt tillämpar så kallade swim-up -tekniker ett centrifugeringssteg och sedan tillåts spermier simma upp i ett medium, vilket berikar en subpopulation av rörliga spermier. Emellertid är användningen av spermiecentrifugering skadlig för spermiernas livsduglighet och framkallar produktion av reaktiva syrearter. Konventionella tekniker används rutinmässigt inom assisterad reproduktionsteknologi.
Flödescytometri
Flödescytometri är en annan metod som används för att sortera spermier och anpassningar av denna teknik öppnar nya möjligheter inom spermiesortering. Men eftersom flödescytometri-baserad spermiesortering ofta använder fluorescerande färgämnen som ofta färgar DNA, är säkerheten för denna teknik inom human reproduktionsmedicin en fråga om vetenskaplig diskussion.
Flödescytometri är emellertid den enda för närvarande använda tekniken som kan bestämma könet på framtida avkommor genom att mäta DNA-innehållet i individuella spermieceller. Den utvärderar om de innehåller den större X-kromosomen (som ger upphov till en kvinnlig avkomma) eller mindre Y-kromosomen (som leder till manlig avkomma). Det tillåter sedan separation av X- och Y-spermier. Den så kallade Beltsfield Sperm Sexing Technology utvecklades av USDA i samarbete med Lawrence Livermore National Laboratories, och förlitade sig på DNA-skillnaden mellan X- och Y-kromosomerna. Innan flödescytometrisk sortering märks sperma med ett fluorescerande färgämne som heter Hoechst 33342 som binder till DNA från varje sperma. Eftersom X-kromosomen är större (dvs. har mer DNA) än Y-kromosomen, kommer den "honliga" (X-kromosombärande) spermatozoerna att absorbera en större mängd färgämne än sin manliga (Y-kromosombärande) motsvarighet. Som en konsekvens, när de utsätts för UV-ljus under flödescytometri, fluorescerar X-spermier ljusare än Y-spermier. När spermatozoerna passerar genom flödescytometern i en fil, omsluts varje spermatozoon av en enda droppe vätska och tilldelas en elektrisk laddning som motsvarar dess kromosomstatus (t.ex. X-positiv laddning, Y-negativ laddning). Strömmen av X- och Y-droppar separeras sedan med hjälp av elektrostatisk avböjning och samlas upp i separata uppsamlingsrör för efterföljande bearbetning.
En annan cytometrisk teknik som används vid spermiesortering är magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) som rutinmässigt används på sjukhus för assisterad befruktning för att sortera ut spermier med fragmenterat DNA. Detta uppnås genom att använda antikroppar mot ytmarkörer för programmerad celldöd ( apoptos ) såsom annexin V , kopplat med magnetiska pärlor. Efter bindningen av dessa antikroppar sorteras spermier som genomgår apoptos genom att applicera magnetfält på spermiesuspensionen. MACS undanröjer behovet av fluorescerande DNA-bindande molekyler.
Andra tekniker
DNA-skada i spermieceller kan upptäckas genom att använda Raman-spektroskopi . Det är dock inte tillräckligt specifikt för att upptäcka individuella egenskaper. De spermieceller som har minst DNA-skada kan därefter injiceras i äggcellen genom intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI). Många andra metoder för spermiesortering har föreslagits eller testas för närvarande.
För att välja spermier med lågt DNA-skadeindex skulle populationen av spermier kunna berikas med spermier med icke-fragmenterat DNA, med tekniker som elektrofores , Z-metoden och MACS (Magnetic Activating Cell Sorting), som i kombination med densitetsgradientcentrifugering i enstaka spermier. protokoll resulterar i spermier med överlägsen kvalitet.
Hyaluronsyra (HA) bindningsställen på spermiernas plasmamembran är en indikator på spermiemognad (Huszar et al., 2003, Yudin et al., 1999). Det finns två metoder baserade på detta faktum: fysiologisk intracytoplasmatisk spermieinjektion (PICSI) och en långsam procedur för spermier; båda metoderna kräver spermieberedning via spermietvättning eller centrifugering.
Ansökningar
Spermier genomgår en process av naturligt urval när miljontals spermier kommer in i slidan men endast ett fåtal når äggcellen och då brukar bara en tillåtas att befrukta den. Spermien väljs inte bara ut av sin högsta rörlighet utan också av andra faktorer som DNA-integritet, produktion av reaktiva syrearter och livsduglighet. Detta urval kringgås till stor del vid provrörsbefruktning, vilket leder till högre förekomst av fosterskador i samband med assisterad befruktning . Äggceller befruktas ofta av spermier som skulle ha låg chans att befrukta dem under naturliga förhållanden. Spermiesortering skulle således kunna användas för att minska riskerna i samband med assisterad befruktning. Dessutom pågår en debatt om att använda spermiesortering för att välja barnets kön.
För allmän hälsa
Konventionella metoder för spermiesortering har använts i stor utsträckning för att bedöma kvaliteten på spermier före efterföljande konstgjord insemination eller provrörsbefruktning . Det har verifierats att spermier som sorterats med dessa tekniker är av överlägsen kvalitet än osorterade. Emellertid förblir viktiga egenskaper hos spermier, såsom DNA-integritet, oprövade med dessa konventionella metoder. Nya flödescytometribaserade tekniker som YO-PRO-färgning kan skilja apoptotiska och döda spermier från de livsdugliga. Till exempel annexin V- färgning följt av MACS avsevärt förbättra graviditetsfrekvensen hos par med tidigare assisterad reproduktionssvikt.
För könsval
I jordbruket
Spermiesortering med flödescytometri är en etablerad teknik inom veterinärpraktiken, och inom mejeriindustrin insemineras de flesta honkor artificiellt med sorterad sperma för att öka antalet honkalvar (att använda spermiesortering är mindre vanligt hos andra arter av lantbruksdjur, hur konstgjorda de än är . insemination är vanligt). Artificiell insemination av lantbruksdjur med sorterad sperma erkänns av Food and Agriculture Organization ( FAO) som ett lovande sätt att öka effektiviteten i jordbruket som behövs för att producera tillräckligt med mat för den växande mänskliga befolkningen. Att använda konstgjord insemination med sorterade spermier ses som ett sätt att skapa ett optimalt förhållande mellan han- och honkalvar för att öka mjölkproduktionen .
I människor
Att välja barns kön kan hjälpa till att förebygga könsrelaterade ärftliga sjukdomar som Duchenes muskeldystrofi eller blödarsjuka i familjer med en historia av dessa sjukdomar. Å andra sidan väcker sortering av spermier hos människor de etiska farhågorna som är implicita för idén om könsval . Om den tillämpas i stor skala, har den en potential att framkalla en obalans mellan könsförhållandet . Det kan också få konsekvenser för jämställdheten om föräldrar konsekvent väljer att ha en pojke som förstfödd (förstfödda visades ha större sannolikhet att lyckas i livet).
Det finns inget land i världen som uttryckligen tillåter könsval för icke-medicinska ändamål. Det fanns 31 länder under 2009 som tillät könsval vid könsbunden sjukdomsrisk eller annat medicinskt syfte. I USA, för människor, regleras tillämpningen av spermiesortering vid könsval hårt av FDA . Efter etableringen av MicroSort-tekniken erbjöds den till föräldrar som en del av en klinisk prövning . Förfarandet gjordes tillgängligt för ett begränsat antal deltagare varje månad, förutom att uppfylla vissa kriterier, som att ha en sjukdom med könskoppling eller att ha minst ett barn (för familjebalansering). Det finns för närvarande MicroSort-laboratorier och samverkande läkare i flera länder (en del för allmänna ändamål, vissa erbjuder endast service vid genetiska sjukdomsrisker förknippade med det ena könet).
Även om det är mycket exakt, kommer spermiesortering genom flödescytometri inte att producera två helt separata populationer. Det vill säga, det kommer alltid att finnas någon "manlig" sperma bland de "kvinnliga" spermierna och vice versa. Den exakta procentuella renheten för varje population beror på arten som sorteras och de "portar" som operatören placerar runt den totala populationen som är synlig för maskinen. I allmänhet, ju större DNA-skillnaden är mellan X- och Y-kromosomen hos en art, desto lättare är det att producera en mycket ren population. Hos får och nötkreatur förblir renheten för varje kön vanligtvis över 90 % beroende på "gating", medan för människor kan dessa reduceras till 90 % för "honliga" spermier och 70% för "manliga" spermier.