Under den engelska fotbollssäsongen 1900–01 tävlade Brentford i Southern League Second Division. En obesegrad ligasäsong ledde till att Brentford toppade divisionen, innan han misslyckades med att slå Swindon Town i en testmatch om uppflyttning och nedflyttning. Befordran garanterades slutligen när klubben valdes in i Southern League First Division i juli 1901.
Trots de slutgiltiga konsekvenserna av att hoppa över hindret från amatör- till professionell status under föregående säsong , gick Brentford in i kampanjen 1900–01 Southern League Second Division i ett sunt tillstånd. Klubben flyttade från Cross Roads (nära South Ealing station ) tillbaka till Brentford och skulle spela sina matcher på Boston Park Cricket Clubs mark York Road, en flytt som var fördelaktig för båda klubbarna. Harry Underwood, medlem i Brentford-kommittén, lyckades också övertala ett antal lokala hantverkare, som klubben var skyldig över 100 pund (motsvarande 11 500 pund 2023), att skriva av skulden. Nu under ledning av William Lewis som en sorts lagledare, trimmade Brentford ner spelarstaben och värvade två nya professionella spelare – vänsterbacken Harry Gilmour och innerforwarden Joe Turner. På grund av minskningen av storleken på Southern League Second Division gick Brentford också in i London League för att hjälpa till att generera intäkter.
Brentford inledde Southern League-säsongen i fin form, men åkte på ett antal förluster i de tidiga London League-matcherna och följaktligen värvades fem nya spelare – målvakten Dave Clear, backen Jack Graham , halvbacken William Hainsworth, innerhögern Roddy McLeod och centern . forwarden Peter Turnbull . McLeod och Turnbull visade sig vara master-stroke-värvningar och tillsammans med befintliga forwards Ralph McElhaney , E. Andrews och Joe Turner sparkade kvintetten Brentford till en obesegrad Southern League-säsong. Binas 1:a plats i andra divisionen ledde till en testmatch i slutet av säsongen mot Swindon Town , som hade slutat botten av första divisionen. Eftersom Brentford behövde vinna för att säkra avancemang och med ställningen 0–0, gick matchen på Elm Park till förlängning och avbröts efter 107 minuter på grund av dåligt ljus.
I efterdyningarna av den övergivna testmatchen beslutade Brentford-kommittén att ansöka om platsen i den första divisionen som lämnades vakant av Bristol City , som hade valts in i Football League . Brentford förpassades till förmån för Northampton Town vid Southern Leagues årsstämma den 1 juni, men Gravesend Uniteds avgång från First Division på grund av ekonomiska problem i juli ledde till att Brentford valdes in i First Division för säsongen 1901–02 .
Ett antal klubbrekord sattes under säsongen:
Flest bortasegrar i Southern League under en säsong: 7
Lägst oavgjorda hemmamatcher i Southern League under en säsong: 1
Minsta Southern League-förluster på en säsong: 0
Minsta hemmaförluster i Southern League på en säsong: 0
Minsta Southern League bortaförluster på en säsong: 0
Rekordvinst i Southern League: 11–1 mot Wycombe Wanderers, 16 februari 1901
Minst målskyttar i alla tävlingar under en Southern League-säsong
Källa: [ citat behövs ] Regler för klassificering: Systemet med att använda målgenomsnitt för att separera två lag bundna på poäng användes fram till säsongen 1976-77. Poängsystemet: 2 poäng för vinst, 1 poäng för oavgjort och 0 poäng för förlust.