Rekombinaspolymerasamplifiering

Rekombinaspolymerasamplifiering (RPA) är ett enkelrör, isotermiskt alternativ till polymeraskedjereaktionen ( PCR) . Genom att lägga till ett omvänt transkriptasenzym till en RPA-reaktion kan det detektera RNA såväl som DNA , utan att behöva ett separat steg för att producera cDNA . Eftersom det är isotermiskt kan RPA använda mycket enklare utrustning än PCR, vilket kräver en termisk cykler . Att fungera bäst vid temperaturer på 37–42 °C och fortfarande arbeta, om än långsammare, vid rumstemperatur innebär att RPA-reaktioner i teorin kan köras snabbt genom att bara hålla i ett rör. Detta gör RPA till en utmärkt kandidat för att utveckla billiga, snabba, punkt-of-care molekylära tester. En internationell kvalitetsbedömning av molekylär detektering av Rift Valley-febervirus utförd samt de bästa RT-PCR-testerna, som detekterar mindre koncentrerade prover som missats av vissa PCR-tester och ett RT-LAMP- test. RPA utvecklades och lanserades av TwistDx Ltd. (tidigare känt som ASM Scientific Ltd), ett bioteknikföretag baserat i Cambridge, Storbritannien.

Metod

RPA-processen använder tre kärnenzymer – ett rekombinas , ett enkelsträngat DNA-bindande protein (SSB) och strängförskjutande polymeras .

Rekombinaser är kapabla att para oligonukleotidprimrar med homolog sekvens i duplex-DNA.

SSB binder till förskjutna DNA-strängar och förhindrar att primrarna förskjuts.

Slutligen börjar det strängförskjutande polymeraset DNA-syntes där primern har bundit till mål-DNA:n.

Genom att använda två motsatta primrar, ungefär som PCR, om målsekvensen verkligen är närvarande, initieras en exponentiell DNA-amplifieringsreaktion . Ingen annan provmanipulation såsom termisk eller kemisk smältning krävs för att initiera amplifiering. Vid optimala temperaturer (37–42 °C) fortskrider reaktionen snabbt och resulterar i specifik DNA-amplifiering från bara ett fåtal målkopior till detekterbara nivåer, vanligtvis inom 10 minuter, för snabb detektering av viralt genomiskt DNA eller RNA, patogent bakteriellt genomiskt DNA såväl som aptamer-DNA med kort längd.

De tre kärn RPA-enzymerna kan kompletteras med ytterligare enzymer för att ge extra funktionalitet. Tillsats av exonukleas III tillåter användning av en exosond för fluorescensdetektion i realtid som liknar realtids-PCR. Tillsats av endonukleas IV innebär att en nfo-sond kan användas för lateral flödesremsdetektion av framgångsrik amplifiering. Om ett omvänt transkriptas som fungerar vid 37–42 °C tillsätts kan RNA transkriberas omvänt och det producerade cDNA:t amplifieras allt i ett steg. För närvarande är endast TwistAmp exo-versionen av RPA tillgänglig med omvänt transkriptas inkluderat, även om användare helt enkelt kan komplettera andra TwistAmp-reaktioner med ett omvänt transkriptas för att ge samma effekt. Liksom med PCR kan alla former av RPA-reaktioner multiplexeras genom tillägg av ytterligare primer/sondpar, vilket möjliggör detektering av flera analyter eller en intern kontroll i samma rör.

Förhållande till andra förstärkningstekniker

RPA är en av flera isotermiska nukleinsyraamplifieringstekniker som ska utvecklas som en molekylär diagnostisk teknik, ofta med syftet att förenkla laboratorieinstrumenteringen som krävs i förhållande till PCR . En partiell lista över andra isotermiska amplifieringstekniker inkluderar LAMP , NASBA , helikasberoende amplifiering (HDA) och nicking enzymamplifieringsreaktion (NEAR). Teknikerna skiljer sig åt i detaljerna för primerdesign och reaktionsmekanism, och i vissa fall (som RPA) använder man sig av cocktails av två eller flera enzymer. Liksom RPA erbjuder många av dessa tekniker snabba amplifieringstider med potential för förenklad instrumentering och rapporterad resistens mot ämnen i orenade prover som är kända för att hämma PCR. Med avseende på förstärkningstid kan moderna termocykler med snabba temperaturramper minska PCR-förstärkningstiderna till mindre än 30 minuter, särskilt för korta amplikoner som använder dubbeltemperaturcykling snarare än de konventionella tretemperaturprotokollen. Dessutom bör kraven på provförberedelse (inklusive lysering och extraktion av DNA eller RNA, om nödvändigt) betraktas som en del av den totala tiden och komplexiteten som är inneboende i tekniken. Dessa krav varierar beroende på tekniken samt det specifika målet och provtypen.

Jämfört med PCR är riktlinjerna för primer- och sonddesign för RPA mindre etablerade och kan kräva en viss grad av försök och misstag, även om de senaste resultaten indikerar att standard PCR-primers också kan fungera. Den allmänna principen för ett diskret amplikon som begränsas av en framåt- och bakåtprimer med en (valfri) intern fluorogen sond liknar PCR. PCR-primrar kan användas direkt i RPA, men deras korta längd betyder att rekombinationshastigheten är låg och RPA kommer inte att vara särskilt känslig eller snabb. Typiskt behövs 30–38 basprimrar för effektiv rekombinasfilamentbildning och RPA-prestanda. Detta är i motsats till vissa andra tekniker såsom LAMP som använder ett större antal primers som är föremål för ytterligare designbegränsningar. Även om den ursprungliga RPA-rapporten från 2006 beskriver en funktionell uppsättning reaktionskomponenter, är den nuvarande (proprietära) formuleringen av TwistAmp-kitet "väsentligt annorlunda" och är endast tillgänglig från TwistDx-leverantören. Detta är i jämförelse med reaktionsblandningar för PCR som är tillgängliga från många leverantörer, eller LAMP eller NASBA för vilka sammansättningen av reaktionsblandningen är fritt publicerad, vilket gör att forskare kan skapa sina egna skräddarsydda "kit" av billiga ingredienser.

Publicerad vetenskaplig litteratur saknar i allmänhet detaljerad jämförelse av prestandan för isotermiska amplifieringstekniker såsom RPA, HDA och LAMP relativt varandra, ofta snarare jämförelse av en enskild isotermisk teknik med en "gold standard" PCR-analys. Detta gör det svårt att bedöma fördelarna med dessa tekniker oberoende av påståenden från tillverkarna, uppfinnarna eller förespråkarna. Dessutom är prestandaegenskaper för någon amplifieringsteknik svåra att frikoppla från primerdesign: en "bra" primeruppsättning för ett mål för RPA kan ge snabbare amplifiering eller mer känslig detektion än en "dålig" LAMP-primeruppsättning för samma mål, men omvänt kan vara sant för olika primeruppsättningar för ett annat mål. Ett undantag är en nyligen genomförd studie som jämför RT-qPCR, RT-LAMP och RPA för detektion av Schmallenberg-virus och bovint viralt diarrévirus, som effektivt gör poängen att varje amplifieringsteknik har styrkor och svagheter, som kan variera beroende på målet, och att egenskaperna hos de tillgängliga amplifieringsteknikerna behöver utvärderas i kombination med kraven för varje applikation. Som med PCR och alla andra amplifieringstekniker finns det uppenbarligen en publikationsbias, med dåligt presterande primeruppsättningar som sällan anses värda att rapportera.