NASBA (molekylärbiologi)
Nukleinsyrasekvensbaserad amplifiering, vanligen kallad NASBA , är en metod inom molekylärbiologi som används för att producera flera kopior av enkelsträngat RNA. NASBA är en tvåstegsprocess som tar RNA och härdar specialdesignade primers, och sedan använder en enzymcocktail för att förstärka den.
Bakgrund
Nukleinsyraamplifiering är en teknik som används för att producera flera kopior av ett specifikt segment av RNA/DNA. Amplifierat RNA och DNA kan användas för en mängd olika tillämpningar, såsom genotypning, sekvensering och detektion av bakterier eller virus. Det finns två olika typer av amplifiering, icke-isotermisk och isotermisk. Icke-isotermisk amplifiering producerar flera kopior av RNA/DNA genom reiterativ cykling mellan olika temperaturer. Isotermisk amplifiering producerar flera kopior av RNA/DNA vid en konstant reaktionstemperatur. NASBA tar enkelsträngat RNA, hybridiserar primrar till det vid 65 ℃ och amplifierar det sedan vid 41 ℃ för att producera flera kopior av enkelsträngat RNA. För att framgångsrik amplifiering ska ske används en enzymcocktail innehållande Avian Myeloblastosis Reverse Transcriptase (AMV-RT), RNase H och RNA-polymeras. AMV-RT syntetiserar en komplementär DNA-sträng (cDNA) från RNA-mallen när primern har hybridiserats. RNase H bryter sedan ned RNA-mallen och den andra primern binder till cDNA:t för att bilda dubbelsträngat DNA, vilket RNA-polymeras använder för att syntetisera kopior av RNA. En nyckelaspekt av NASBA är att utgångsmaterialet och slutprodukten alltid är enkelsträngat RNA. Med detta sagt kan det användas för att amplifiera DNA, men DNA:t måste översättas till RNA för att framgångsrik amplifiering ska ske.
Loop-medierad isoterm amplifiering (LAMP) är en annan isoterm amplifieringsteknik.
Historia
NASBA utvecklades av J Compton 1991, som definierade det som "en primerberoende teknologi som kan användas för kontinuerlig amplifiering av nukleinsyror i en enda blandning vid en temperatur". Omedelbart efter uppfinningen av NASBA användes den för snabb diagnos och kvantifiering av HIV-1 i patientsera. Även om RNA också kan amplifieras med PCR med användning av ett omvänt transkriptas (för att syntetisera en komplementär DNA-sträng som mall), är NASBA:s främsta fördel att den fungerar under isotermiska förhållanden – vanligtvis vid en konstant temperatur på 41 °C eller två olika temperaturer beroende på vilka primrar och enzymer som används. Även när två olika temperaturer tillämpas anses det fortfarande vara isotermiskt, eftersom det inte cyklar fram och tillbaka mellan dessa temperaturer. NASBA kan användas i medicinsk diagnostik som ett alternativ till PCR som är snabbare och känsligare under vissa omständigheter.
Procedur
Kort förklarat fungerar NASBA enligt följande:
- RNA-mall tillsatt till reaktionsblandningen, den första primern med T7-promotorregionen på sin 5'-ände fäster till dess komplementära ställe vid 3'-änden av mallen.
- Omvänt transkriptas syntetiserar den motsatta komplementära DNA- strängen som sträcker sig 3'-änden av primern och rör sig uppströms längs RNA-mallen.
- RNAse H förstör RNA-mallen från DNA-RNA-föreningen (RNAse H förstör endast RNA i RNA-DNA-hybrider, men inte enkelsträngat RNA).
- Den andra primern fäster vid 5'-änden av (antisens) DNA-strängen.
- Omvänt transkriptas syntetiserar återigen en annan DNA-sträng från den fästa primern, vilket resulterar i dubbelsträngat DNA.
- T7 RNA-polymeras binder till promotorregionen på dubbelsträngen. Eftersom T7-RNA-polymeras endast kan transkribera i 3' till 5'-riktningen transkriberas sense-DNA och ett antisens-RNA produceras. Detta upprepas och polymeraset producerar kontinuerligt komplementära RNA-strängar av denna mall vilket resulterar i amplifiering.
- Nu kan en cyklisk fas börja liknande de tidigare stegen. Här binder emellertid den andra primern först till (-)RNA:t
- Det omvända transkriptaset producerar nu en (+)cDNA/(-)RNA-duplex.
- RNAse H bryter åter ner RNA:t och den första primern binder till det nu enkelsträngade +(cDNA)
- Det omvända transkriptaset producerar nu det komplementära (-) DNA:t, vilket skapar en dsDNA-duplex
- Precis som steg 6 binder T7-polymeraset till promotorregionen för att producera (-)RNA, och cykeln är fullbordad.
Kliniska applikationer
NASBA-tekniken har använts för att utveckla snabba diagnostiska tester för flera patogena virus med enkelsträngade RNA-genom, t.ex. influensa A, zikavirus, mul- och klövsjukevirus , allvarligt akut respiratoriskt syndrom ( SARS )-associerat coronavirus , humant bocavirus (HBoV) och även parasiter som Trypanosoma brucei .
Nyligen har NASBA-reaktion med fluorescens, oljesticka och nästa generations sekvenseringsavläsning utvecklats för COVID-19-diagnos.