Helikasberoende förstärkning
Helikasberoende amplifiering (HDA) är en metod för in vitro DNA- amplifiering (som polymeraskedjereaktionen ) som sker vid konstant temperatur.
Introduktion
Polymeraskedjereaktionen är den mest använda metoden för DNA-amplifiering in vitro för molekylärbiologi och biomedicinsk forskning. Denna process involverar separation av det dubbelsträngade DNA:t i hög värme till enkelsträngar (denatureringssteget, vanligtvis uppnått vid 95–97 °C), hybridisering av primrarna till det enkelsträngade DNA:t (annealingssteget) och kopiering av enkelsträngen strängar för att skapa nytt dubbelsträngat DNA (förlängningssteget som kräver DNA-polymeraset) kräver att reaktionen görs i en termisk cykler . Dessa bänkmaskiner är stora, dyra och dyra att driva och underhålla, vilket begränsar de potentiella tillämpningarna av DNA-amplifiering i situationer utanför laboratoriet (t.ex. vid identifiering av potentiellt farliga mikroorganismer på undersökningsplatsen eller vid platsen för undersökningen vård av en patient). Även om PCR vanligtvis förknippas med termisk cykling, är det ursprungliga patentet av Mullis et al. avslöjade användningen av ett helikas som ett medel för denaturering av dubbelsträngat DNA och därigenom innefattande isotermisk nukleinsyraamplifiering. In vivo replikeras DNA av DNA-polymeraser med olika tillbehörsproteiner, inklusive ett DNA-helikas som verkar för att separera DNA:t genom att avveckla DNA-dubbelhelixen. HDA utvecklades utifrån detta koncept, med hjälp av ett helikas (ett enzym ) för att denaturera DNA.
Metodik
Strängar av dubbelsträngat DNA separeras först av ett DNA-helikas och beläggs med enkelsträngat DNA (ssDNA)-bindande proteiner. I det andra steget hybridiserar två sekvensspecifika primrar till varje kant av DNA-mallen. DNA-polymeraser används sedan för att förlänga primrarna som hybridiserats till mallarna för att producera ett dubbelsträngat DNA och de två nysyntetiserade DNA-produkterna används sedan som substrat av DNA-helikaser och går in i nästa omgång av reaktionen. Således utvecklas en samtidig kedjereaktion, vilket resulterar i exponentiell amplifiering av den valda målsekvensen (se Vincent et al. . , 2004 för ett schematiskt diagram).
Presentera framsteg och fördelar och nackdelar med HDA
Sedan publiceringen av upptäckten har HDA-teknologin använts för ett "enkelt nukleinsyratest som är lätt att anpassa för detektering av Clostridium difficile" . Andra tillämpningar inkluderar snabb detektering av Staphylococcus aureus genom amplifiering och detektering av en kort DNA-sekvens som är specifik för bakterien. Fördelarna med HDA är att det tillhandahåller en snabb metod för nukleinsyraamplifiering av ett specifikt mål vid en isoterm temperatur som inte kräver en termisk cykler. Men optimeringen av primers och ibland buffertar krävs i förväg av forskaren. Normalt testas och uppnås primer- och buffertoptimering genom PCR, vilket väcker frågan om behovet av att spendera extra på ett separat system för att göra själva amplifieringen. Trots försäljningsargumentet att HDA förnekar användningen av en termisk cykler och därför tillåter forskning att bedrivas på fältet, utförs mycket av det arbete som krävs för att upptäcka potentiellt farliga mikroorganismer i en forsknings-/sjukhuslabbmiljö oavsett. För närvarande kan massdiagnoser från ett stort antal prover ännu inte uppnås med HDA, medan PCR-reaktioner utförda i termisk cykler som kan hålla provplattor med flera brunnar möjliggör amplifiering och detektering av det avsedda DNA-målet från maximalt 96 prover. Kostnaden för att köpa reagenser för HDA är också relativt dyra jämfört med PCR-reagens, mer så eftersom det kommer som ett färdigt kit.