Loop-medierad isoterm förstärkning
Loop-medierad isotermisk amplifiering ( LAMP ) är en enkelrörsteknik för amplifiering av DNA och ett billigt alternativ för att upptäcka vissa sjukdomar. Omvänd transkriptionsloop-medierad isotermisk amplifiering (RT-LAMP) kombinerar LAMP med ett omvänt transkriptionssteg för att möjliggöra detektion av RNA.
LAMP är en isotermisk nukleinsyraamplifieringsteknik. I motsats till polymeraskedjereaktionsteknologin (PCR), där reaktionen utförs med en serie alternerande temperatursteg eller cykler, utförs isotermisk amplifiering vid en konstant temperatur och kräver ingen termisk cykler .
Metod
I LAMP amplifieras målsekvensen vid en konstant temperatur på 60–65 °C (140–149 °F) med användning av antingen två eller tre uppsättningar primrar och ett polymeras med hög strängförskjutningsaktivitet utöver en replikationsaktivitet. Vanligtvis används 4 olika primrar för att amplifiera 6 distinkta regioner på målgenen, vilket ökar specificiteten. Ett ytterligare par "loop-primers" kan ytterligare accelerera reaktionen. Mängden DNA som produceras i LAMP är avsevärt högre [ citat behövs ] än PCR -baserad amplifiering. Primerdesign kan utföras med flera program, såsom PrimerExplorer , MorphoCatcher och NEB LAMP Primer Design Tool . För screening av konservativa och artspecifika nukleotidpolymorfismer i de flesta diagnostiska tillämpningar är en kombination av PrimerExplorer och MorphoCatcher mycket användbar, eftersom det gör det möjligt att lokalisera de artspecifika nukleotiderna vid 3'-ändarna av primrar för att förbättra reaktionens specificitet.
.png)
Amplifieringsprodukten kan detekteras via fotometri, mätning av grumligheten orsakad av magnesiumpyrofosfatfällning i lösning som en biprodukt av amplifiering. Detta möjliggör enkel visualisering med blotta ögat eller via enkla fotometriska detektionsmetoder för små volymer. Reaktionen kan följas i realtid antingen genom att mäta grumligheten eller genom fluorescens med användning av interkalerande färgämnen såsom SYTO 9. Färgämnen, såsom SYBR grön , kan användas för att skapa en synlig färgförändring som kan ses med blotta ögat utan behovet av dyr utrustning, eller av en respons som mer exakt kan mätas med instrumentering. Färgämnesmolekyler interkalerar eller direkt märker DNA:t, och kan i sin tur korreleras med antalet kopior som initialt finns närvarande. Därför kan LAMP också vara kvantitativ.
Detektering i rör av LAMP-DNA-amplifiering är möjlig med manganladdat kalcein som börjar fluorescera vid komplexbildning av mangan med pyrofosfat under in vitro-DNA-syntes.
En annan metod för visuell detektering av LAMP-amplikonerna med blotta ögat baserades på deras förmåga att hybridisera med komplementärt guld nanopartikelbundet (AuNP) enkelsträngat DNA (ssDNA) och därmed förhindra den normala röda till lila-blå färgförändringen som skulle annars uppstår under salt-inducerad aggregation av guldpartiklarna. Så en LAMP-metod kombinerad med amplikondetektion av AuNP kan ha fördelar jämfört med andra metoder när det gäller minskad analystid, amplikonbekräftelse genom hybridisering och användning av enklare utrustning (dvs. inget behov av en termocykler, elektroforesutrustning eller en UV-transilluminator ).
Användningsområden och fördelar
LAMP är en relativt ny DNA-amplifieringsteknik, som på grund av sin enkelhet, robusthet och låga kostnad kan ge stora fördelar. LAMP har potential att användas som en enkel screeninganalys i fält eller vid vårdpunkten av läkare. Eftersom LAMP är isotermiskt, vilket eliminerar behovet av dyra termocykler som används i konventionell PCR, kan det vara en särskilt användbar metod för diagnostik av infektionssjukdomar i låg- och medelinkomstländer. LAMP studeras brett för att upptäcka infektionssjukdomar som filariasis, Zika-virus, tuberkulos, malaria, sömnsjuka och SARS-CoV-2 . I utvecklingsregioner har det ännu inte utförts validerat för andra vanliga patogener.
LAMP har observerats vara mindre känslig (mer resistent) än PCR för inhibitorer i komplexa prover som blod, troligtvis på grund av användning av ett annat DNA-polymeras (vanligtvis Bst – Bacillus stearothermophilus – DNA-polymeras snarare än Taq -polymeras som i PCR). Flera rapporter beskriver framgångsrik upptäckt av patogener från minimalt bearbetade prover som värmebehandlat blod eller i närvaro av kliniska provmatriser. Denna funktion hos LAMP kan vara användbar i låga resurser eller fältmiljöer där en konventionell DNA- eller RNA-extraktion före diagnostisk testning kan vara opraktisk.
LAMP har också använts för att hjälpa till att identifiera kroppsvätskor. Med sin enkelhet kan forskare testa ett eller flera prover med små händer i tid, vilket hjälper till att minska tiden som behövs för att få resultat. Forskare har också kunnat lägga till faktorer för att göra identifieringen ännu enklare, inklusive metallindikatorfärg och fenolrött för att kunna använda en smartphone respektive blotta ögat för att analysera resultaten.
Begränsningar
LAMP är mindre mångsidig än PCR, den mest väletablerade nukleinsyraamplifieringstekniken. LAMP är användbar främst som en diagnostisk eller detektionsteknik, men är inte användbar för kloning eller många andra molekylärbiologiska tillämpningar som möjliggörs av PCR. Eftersom LAMP använder 4 (eller 6) primers riktade mot 6 (eller 8) regioner inom ett ganska litet segment av genomet, och eftersom primerdesign är föremål för många begränsningar, är det svårt att designa primeruppsättningar för LAMP "med ögat". Gratis, öppen källkod eller kommersiella mjukvarupaket används vanligtvis för att hjälpa till med LAMP-primerdesign, även om primerdesignbegränsningarna innebär att det finns mindre frihet att välja målplats än med PCR.
I en diagnostisk tillämpning måste detta balanseras mot behovet av att välja ett lämpligt mål (t.ex. ett konserverat ställe i ett mycket variabelt viralt genom, eller ett mål som är specifikt för en viss patogenstam). Flera degenererade sekvenser kan krävas för att täcka de olika variantstammarna av samma art. En konsekvens av att ha en sådan cocktail av primrar kan vara ospecifik amplifiering i den sena amplifieringen.
Multiplexeringsmetoder för LAMP är mindre utvecklade än för PCR. Det större antalet primrar per mål i LAMP ökar sannolikheten för primer-primer-interaktioner för multiplexerade måluppsättningar. Produkten av LAMP är en serie konkatemerer av målregionen, som ger upphov till ett karakteristiskt "stege" eller bandmönster på en gel, snarare än ett enda band som med PCR. Även om detta inte är ett problem vid detektering av enstaka mål med LAMP, är "traditionella" (endpoint) multiplex PCR-applikationer där identiteten för ett mål bekräftas av storleken på ett band på en gel inte möjliga med LAMP. Multiplexering i LAMP har uppnåtts genom att välja en målregion med ett restriktionsställe och smälta innan den körs på en gel, så att varje produkt ger upphov till en distinkt storlek på fragmentet, även om detta tillvägagångssätt lägger till komplexitet till den experimentella designen och protokollet.
Användningen av ett strängförskjutande DNA-polymeras i LAMP utesluter också användningen av hydrolyssonder, t.ex. TaqMan- prober, som är beroende av 5'-3'- exonukleasaktiviteten hos Taq -polymeras. En alternativ realtidsmultiplexeringsmetod baserad på fluorescensdämpare har rapporterats.
SYBR grön färg kan läggas till för att se LAMPA i realtid. Men i den sena amplifieringen kan primer-dimer-amplifiering bidra till en falsk positiv signal. Användningen av oorganiskt pyrofosfatas i en SYBR-reaktionsblandning tillåter användningen av smältanalys för att särskilja korrekt amplifiering
Även om olika begränsningsstrategier har föreslagits för falskt positiva resultat i analyser baserade på denna metod, är ospecifik amplifiering på grund av olika faktorer inklusive frånvaron av temperaturstyrningsmekanismer en av de största begränsningarna för loop-medierad isoterm amplifiering.
Slutligen, eftersom LAMP kräver bibehållna, förhöjda inkubationstemperaturer (60–65 °C), krävs någon form av uppvärmningsmekanism, termostat och/eller isolator (men inte nödvändigtvis en termisk cykler). Detta krav gör LAMP mindre idealiskt för fältdiagnostik som helst skulle fungera vid omgivningstemperatur.