Proteinfällning

Proteinfällning används i stor utsträckning i nedströms bearbetning av biologiska produkter för att koncentrera proteiner och rena dem från olika föroreningar. Till exempel, inom bioteknikindustrin används proteinfällning för att eliminera föroreningar som vanligtvis finns i blod. Den underliggande utfällningsmekanismen är att ändra lösningsmedlets solvatiseringspotential, närmare bestämt genom att sänka det lösta ämnets löslighet genom tillsats av ett reagens.

Generella principer

Lösligheten av proteiner i vattenhaltiga buffertar beror på fördelningen av hydrofila och hydrofoba aminosyrarester på proteinets yta . Hydrofoba rester förekommer övervägande i den globulära proteinkärnan, men vissa finns i fläckar på ytan. Proteiner som har hög hydrofob aminosyrahalt på ytan har låg löslighet i ett vattenhaltigt lösningsmedel. Laddade och polära ytrester interagerar med jongrupper i lösningsmedlet och ökar lösligheten av ett protein. Kunskap om ett proteins aminosyrasammansättning kommer att hjälpa till att bestämma ett idealiskt utfällningslösningsmedel och metoder.

Repulsiv elektrostatisk kraft

Repulsiva elektrostatiska krafter bildas när proteiner löses i en elektrolytlösning . Dessa frånstötande krafter mellan proteiner förhindrar aggregering och underlättar upplösning. Vid upplösning i en elektrolytlösning migrerar lösningsmedelsmotjoner mot laddade ytrester på proteinet och bildar en stel matris av motjoner på proteinets yta. Bredvid detta skikt finns ett annat solvatiseringsskikt som är mindre styvt och, när man rör sig bort från proteinytan, innehåller en minskande koncentration av motjoner och en ökande koncentration av kojoner. Närvaron av dessa solvatiseringsskikt gör att proteinet har färre joniska interaktioner med andra proteiner och minskar sannolikheten för aggregering. Repulsiva elektrostatiska krafter bildas också när proteiner löses i vatten. Vatten bildar ett solvatiseringsskikt runt de hydrofila ytresterna av ett protein. Vatten etablerar en koncentrationsgradient runt proteinet, med den högsta koncentrationen på proteinytan. Detta vattennätverk har en dämpande effekt på attraktionskrafterna mellan proteiner.

• 

  Joniskt solvatiseringsskikt

• 

  Hydreringsskikt

Attraktiv elektrostatisk kraft

Dispersiva eller attraktionskrafter existerar mellan proteiner genom permanenta och inducerade dipoler . Till exempel kan basiska rester på ett protein ha elektrostatiska interaktioner med sura rester på ett annat protein. Men solvatisering av joner i en elektrolytisk lösning eller vatten kommer att minska protein-proteinattraktionskrafterna. Därför, för att fälla ut eller inducera ackumulering av proteiner, bör hydratiseringsskiktet runt proteinet reduceras. Syftet med de tillsatta reagensen vid proteinfällning är att minska hydratiseringsskiktet.

• 

  Hydreringsskikt

Utfällningsbildning

Bildning av proteinfällningar sker i en stegvis process. Först tillsätts ett utfällningsmedel och lösningen blandas stadigt. Blandning gör att fällningsmedlet och proteinet kolliderar. Tillräcklig blandningstid krävs för att molekyler ska diffundera över vätskevirvlarna. Därefter genomgår proteiner en kärnbildningsfas , där proteinaggregat av submikroskopisk storlek, eller partiklar, genereras. Tillväxten av dessa partiklar är under Brownsk diffusionskontroll. När partiklarna når en kritisk storlek (0,1 µm till 10 µm för hög- respektive lågskjuvningsfält ) , genom diffusiv tillsats av individuella proteinmolekyler till den, fortsätter de att växa genom att kollidera med varandra och klibba eller flockulera . Denna fas sker i en långsammare takt. Under det sista steget, som kallas åldrande i ett skjuvningsfält, kolliderar fällningspartiklarna upprepade gånger och fastnar, och bryts sedan isär tills en stabil medelpartikelstorlek uppnås, vilket är beroende av individuella proteiner. Den mekaniska styrkan hos proteinpartiklarna korrelerar med produkten av medelskjuvhastigheten och åldringstiden, vilket är känt som Camp-talet. Åldring hjälper partiklar att motstå de vätskeskjuvkrafter som uppstår i pumpar och centrifugmatningszoner utan att minska i storlek.

Metoder

Salta ut

Utsaltning är den vanligaste metoden som används för att fälla ut ett protein. Tillsats av ett neutralt salt, såsom ammoniumsulfat , komprimerar solvatiseringsskiktet och ökar interaktionen mellan protein och protein. När saltkoncentrationen i en lösning ökar interagerar laddningarna på ytan av proteinet med saltet, inte vattnet, och exponerar därigenom hydrofoba fläckar på proteinytan och gör att proteinet faller ur lösningen (aggregerar och fälls ut).

Energi inblandad i utsaltning

Utsaltning är en spontan process när rätt koncentration av saltet uppnås i lösning. De hydrofoba fläckarna på proteinytan genererar högordnade vattenskal. Detta resulterar i en liten minskning av entalpi , Δ H , och en större minskning av entropi , Δ S, för de ordnade vattenmolekylerna i förhållande till molekylerna i bulklösningen. Den totala förändringen av den fria energin , Δ G , av processen ges av Gibbs frienergiekvation:

$\Delta G=\Delta HT\Delta S.$

Δ G = Fri energiförändring, Δ H = Entalpiförändring vid nederbörd, Δ S = Entropiförändring vid nederbörd, T = Absolut temperatur. När vattenmolekyler i det stela solvatiseringslagret förs tillbaka till bulkfasen genom interaktioner med det tillsatta saltet, orsakar deras större rörelsefrihet en betydande ökning av deras entropi. Således blir Δ G negativ och utfällning sker spontant.

Hofmeister-serien

Kosmotroper eller "vattenstrukturstabilisatorer" är salter som främjar avledning/dispergering av vatten från solvatiseringsskiktet runt ett protein. Hydrofoba fläckar exponeras sedan på proteinets yta och de interagerar med hydrofoba fläckar på andra proteiner. Dessa salter förbättrar proteinaggregation och utfällning. Kaotroper eller "vattenstrukturbrytare" har motsatt effekt av Kosmotroper. Dessa salter främjar en ökning av solvatiseringsskiktet runt ett protein. Effektiviteten av de kosmotropa salterna i utfällning av proteiner följer ordningen för Hofmeister-serien:

Mest nederbörd $\mathrm {PO_{4}^{3-}>SO_{4}^{2-}>COO^ {-}>Cl^{-}}$ minsta nederbörd

Mest nederbörd $\mathrm {NH_{4}^{+}>K^{+}>Na^{+}}$ minsta nederbörd

Utsaltning i praktiken

Minskningen i proteinlöslighet följer en normaliserad löslighetskurva av den typ som visas. Förhållandet mellan lösligheten av ett protein och ökande jonstyrka hos lösningen kan representeras av Cohns ekvation:

$\log S=B-KI\,$

S = proteinets löslighet, B är idealiserad löslighet, K är en saltspecifik konstant och I är lösningens jonstyrka, som tillskrivs det tillsatta saltet.

$I={\begin{matrix}{\frac {1}{2}}\end{matrix}}\sum _{i=1}^ {n}c_{i}z_{i}^{2}$

z _i är saltets jonladdning och c _i är saltkoncentrationen. Det ideala saltet för proteinfällning är mest effektivt för en viss aminosyrasammansättning, billigt, icke-buffrande och icke-förorenande. Det vanligaste saltet är ammoniumsulfat . Det finns en låg variation i utsaltning över temperaturer 0 °C till 30 °C. Proteinfällningar som finns kvar i saltlösningen kan förbli stabila i åratal skyddade från proteolys och bakteriell kontaminering av de höga saltkoncentrationerna.

• 

  Löslighetskurva

Isoelektrisk nederbörd

Den isoelektriska punkten (pI) är pH i en lösning vid vilken den primära nettoladdningen av ett protein blir noll. Vid ett lösnings-pH som är över pI är ytan av proteinet övervägande negativt laddad och därför kommer lika-laddade molekyler att uppvisa avstötande krafter. På samma sätt, vid ett lösnings-pH som är under pl, är proteinets yta övervägande positivt laddad och avstötning mellan proteiner inträffar. Vid pI upphävs emellertid de negativa och positiva laddningarna, repulsiva elektrostatiska krafter reduceras och attraktionskrafterna dominerar. Attraktionskrafterna kommer att orsaka aggregering och nederbörd. PI för de flesta proteiner ligger i pH-intervallet 4–6. Mineralsyror, såsom saltsyra och svavelsyra, används som utfällningsmedel. Den största nackdelen med isoelektrisk punktutfällning är den irreversibla denatureringen som orsakas av mineralsyrorna. Av denna anledning används isoelektrisk punktutfällning oftast för att fälla ut kontaminerande proteiner, snarare än målproteinet. Utfällningen av kasein under osttillverkning, eller under produktion av natriumkaseinat, är en isoelektrisk utfällning.

Utfällning med blandbara lösningsmedel

Tillsats av blandbara lösningsmedel såsom etanol eller metanol till en lösning kan orsaka att proteiner i lösningen fälls ut. Solvatiseringsskiktet runt proteinet kommer att minska när det organiska lösningsmedlet successivt tränger undan vatten från proteinytan och binder det i hydratiseringsskikt runt de organiska lösningsmedelsmolekylerna. Med mindre hydratiseringsskikt kan proteinerna aggregera genom attraktiva elektrostatiska krafter och dipolkrafter. Viktiga parametrar att beakta är temperatur, som bör vara lägre än 0 °C för att undvika denaturering , pH och proteinkoncentration i lösning. Blandbara organiska lösningsmedel minskar den dielektriska konstanten för vatten, vilket i själva verket tillåter två proteiner att komma nära varandra. Vid den isoelektriska punkten ges förhållandet mellan dielektricitetskonstanten och proteinlösligheten av:

$\log S=k/e^{2}+\log S^{0}\,$

⁰ S är ett extrapolerat värde på S , e är blandningens dielektricitetskonstant och k är en konstant som hänför sig till vattnets dielektriska konstant. Cohn -processen för plasmaproteinfraktionering bygger på lösningsmedelsutfällning med etanol för att isolera individuella plasmaproteiner.

en klinisk tillämpning för användningen av metanol som ett proteinutfällningsmedel är i uppskattningen av bilirubin.

Nonjoniska hydrofila polymerer

Polymerer , såsom dextraner och polyetylenglykoler , används ofta för att fälla ut proteiner eftersom de har låg brännbarhet och är mindre benägna att denaturera biomaterial än isoelektrisk utfällning. Dessa polymerer i lösning lockar vattenmolekyler bort från solvatiseringsskiktet runt proteinet. Detta ökar protein-protein-interaktionerna och ökar utfällningen. För det specifika fallet med polyetylenglykol kan utfällning modelleras med ekvationen:

$\ln(S)+pS=X-aC\,$

C är polymerkoncentrationen, P är en protein-protein-interaktionskoefficient, a är en protein-polymer-interaktionskoefficient och

$x=(\mu _{i}-\mu _{i}^{0})RT$

μ är den kemiska potentialen för komponent I, R är den universella gaskonstanten och T är den absoluta temperaturen.

Flockning av polyelektrolyter

Alginat , karboximetylcellulosa, polyakrylsyra, garvsyra och polyfosfater kan bilda utökade nätverk mellan proteinmolekyler i lösning. Effektiviteten hos dessa polyelektrolyter beror på lösningens pH. Anjoniska polyelektrolyter används vid pH-värden lägre än den isoelektriska punkten. Katjoniska polyelektrolyter har pH-värden över pI. Det är viktigt att notera att ett överskott av polyelektrolyter kommer att få fällningen att lösas tillbaka i lösningen. Ett exempel på polyelektrolytflockning är avlägsnandet av proteinmoln från ölört med hjälp av irländsk mossa .

Flervärda metalljoner

Metallsalter kan användas i låga koncentrationer för att fälla ut enzymer och nukleinsyror från lösningar. Flervärda metalljoner som ofta används är Ca ²⁺ , Mg ²⁺ , Mn ²⁺ eller Fe ²⁺ .

Nederbördsreaktorer

Det finns många industriella reaktorer som kan användas för att fälla ut stora mängder proteiner, såsom rekombinanta DNA-polymeraser från en lösning. [1]

Satsreaktorer

Satsreaktorer är den enklaste typen av utfällningsreaktorer. Utfällningsmedlet tillsätts långsamt till proteinlösningen under blandning. De aggregerande proteinpartiklarna tenderar att vara kompakta och regelbundna till formen. Eftersom partiklarna utsätts för ett brett spektrum av skjuvspänningar under lång tid tenderar de att vara kompakta, täta och mekaniskt stabila.

Rörformiga reaktorer

I rörformiga reaktorer bringas foderproteinlösning och utfällningsreagenset i kontakt i en zon med effektiv blandning och matas sedan in i långa rör där utfällning sker. Vätskevolymelementen närmar sig pluggflöde när de rör sig genom reaktorns rör. Turbulent flöde främjas genom trådnätinsatser i röret. Rörreaktorn kräver inga rörliga mekaniska delar och är billig att bygga. Reaktorn kan dock bli opraktisk lång om partiklarna aggregerar långsamt.

Kontinuerliga omrörda tankreaktorer (CSTR)

CSTR- reaktorer körs i stationärt tillstånd med ett kontinuerligt flöde av reaktanter och produkter i en välblandad tank. Färskt proteinfoder kommer i kontakt med slurry som redan innehåller fällningspartiklar och fällningsreagenserna.

•   Zellner; et al. (juni 2005). "Kvantitativ validering av olika proteinutfällningsmetoder i proteomanalys av blodplättar". Elektrofores . 26 (12): 2481–9. doi : 10.1002/elps.200410262 . PMID 15895463 .
• Harrison et al., Bioseparations Science and Engineering. Oxford University Press. New York, NY 2003.
• Shuler et al., Bioprocess Engineering: Basic Concepts (2nd Edition). Prentice Hall International. 2001
• Ladisch. Bioseparationsteknik . John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 2001.
• Lydersen. Bioprocessteknik. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1994.
• Belter, Paul A. Bioseparations: nedströms bearbetning för bioteknik. John Wiley & Sons, Inc. New York, NY 1988.