Funktionell kloning

Arbetsflöde för att använda urval i ett funktionellt kloningsexperiment. Här väljs endast gener som ger ampicillinresistens .

Funktionell kloning är en molekylär kloningsteknik som bygger på förkunskaper om det kodade proteinets sekvens eller funktion för genidentifiering . I denna analys screenas ett genomiskt eller cDNA-bibliotek för att identifiera den genetiska sekvensen för ett protein av intresse. Expressions- cDNA-bibliotek kan screenas med antikroppar specifika för proteinet av intresse eller kan förlita sig på selektion via proteinfunktionen. Historiskt sett användes aminosyrasekvensen för ett protein för att framställa degenererade oligonukleotider som sedan sonderades mot biblioteket för att identifiera genen som kodar för proteinet av intresse. När väl kandidatkloner som bär genen av intresse har identifierats, sekvenseras de och deras identitet bekräftas. Denna metod för kloning gör det möjligt för forskare att screena hela genom utan förkunskaper om genens lokalisering eller den genetiska sekvensen.

Denna teknik kan användas för att identifiera gener som kodar för liknande proteiner från en organism till en annan. På liknande sätt kan denna teknik paras med metagenomiska bibliotek för att identifiera nya gener och proteiner som utför liknande funktioner, såsom identifiering av nya antibiotika genom att screena för beta-laktamasaktivitet eller välja tillväxt i närvaro av penicillin .

Experimentellt arbetsflöde

Genomiskt bibliotek i Saccharomyces cerevisiae -värd.

Arbetsflödet för ett funktionellt kloningsexperiment varierar beroende på källan till genetiskt material, omfattningen av förkunskaper om proteinet eller genen av intresse och förmågan att screena för proteinfunktionen. I allmänhet består ett funktionellt kloningsexperiment av fyra steg: 1) provinsamling, 2) biblioteksberedning, 3) screening eller selektion och 4) sekvensering .

Provsamling

Genetiskt material samlas in från en viss celltyp, organism eller miljöprov som är relevant för den biologiska frågan. Vid funktionell kloning isoleras vanligtvis mRNA och cDNA framställs från det isolerade mRNA:t ( RNA-extraktion) . Under vissa omständigheter genomiskt DNA isoleras, särskilt när miljöprover används som källa till genetiskt material.

Biblioteksförberedelser

Se även: genomiskt bibliotek och cDNA-bibliotek

Om utgångsmaterialet är genomiskt DNA , klipps DNA:t för att producera fragment av lämplig längd för den valda vektorn . DNA-fragmenten eller cDNA behandlas sedan med restriktionsendonukleaser och ligeras till en plasmid eller kromosomala vektorer. I fallet med analyser som screenar för proteinet eller dess funktion, används en expressionsvektor för att säkerställa att genprodukten uttrycks. Vektorvalet kommer att bero på ursprunget för DNA eller cDNA för att säkerställa korrekt uttryck och för att säkerställa att den kodade genen kommer att falla inom gränserna för vektorns insättningsstorlek.

Valet av värd är viktigt för att säkerställa att kodonanvändningen kommer att likna donatororganismen. Värden kommer också att behöva garantera att de korrekta posttranslationella modifieringarna och proteinveckningen kommer att ske för att möjliggöra korrekt funktion av de uttryckta proteinerna.

Screening eller urval

Metoden för att screena de beredda genomiska eller cDNA-biblioteken för genen av intresse är mycket varierande beroende på den experimentella designen och den biologiska frågan. En metod för screening är att undersöka kolonier via Southern blotting med degenererade oligonukleotider framställda från aminosyrasekvensen för sökproteinet. I expressionsbibliotek kan proteinet av intresse identifieras genom screening med en antikropp specifik för frågeproteinet via Western blotting för att identifiera kolonier som bär genen av intresse. Under andra omständigheter kan en specifik analys användas för att screena eller välja för proteinets aktivitet. Till exempel kan gener som ger antibiotikaresistens selekteras genom att odla kolonierna i biblioteket på media som innehåller ett specificerat antibiotikum . Ett annat exempel är screening för enzymatisk aktivitet genom att inkubera med ett substrat som katalyseras till en kolorimetrisk förening som lätt kan visualiseras.

Sekvensering

Se även: DNA-sekvensering

Det sista steget av funktionell kloning är att sekvensera DNA eller cDNA från klonerna som framgångsrikt identifierades i screening- eller urvalssteget. Sekvensen kan sedan annoteras och användas för nedströmsapplikationer, såsom proteinuttryck och rening för industriella applikationer.

Fördelar

Fördelarna med funktionell kloning inkluderar förmågan att screena för nya gener med önskade tillämpningar i organismer som inte kan odlas, särskilt från bakterie- eller virala prover. Dessutom kan gener som kodar för proteiner med relaterade funktioner identifieras när det finns låg sekvenslikhet på grund av förmågan att screena för enbart proteinfunktionen. Funktionell kloning möjliggör genidentifiering utan förkunskaper om organismens genomsekvens eller position för genen i genomet.

Begränsningar

Som med andra kloningstekniker, påverkar vektor- och värdval framgången för genidentifiering via funktionell kloning på grund av kloningsbias. Vektorn måste ha en insättningsstorlek som kommer att rymma hela DNA-sekvensen av det uttryckta proteinet. I expressionsvektorer måste dessutom promotorerna och terminatorerna fungera inom den valda värdorganismen. Värdvalet kan påverka transkription och translation på grund av olika kodonanvändning , transkriptionellt och translationellt maskineri eller posttranslationella modifieringar inom värden.

Andra begränsningar inkluderar den arbetsintensiva biblioteksförberedelsen och potentiella skärmar som kan vara både dyra och tidskrävande.

Alternativa tillvägagångssätt

Positionell kloning

Flödesschema för att bestämma den optimala kloningsstrategin.

Positionell kloning är en annan molekylär kloningsteknik för identifiering av en gen av intresse. Denna metod använder exakt kromosomal placering istället för funktion för att styra genidentifiering. På grund av detta fokuserar denna metod på allt genetiskt material på ett kromosomalt locus och gör inga antaganden om funktion. I modellorganismer som möss eller jäst används denna metod oftare eftersom informationen om positionen för en gen av intresse kan erhållas från det sekvenserade genomet . Denna metod blir dock mycket mer besvärlig när sekvensinformation inte är tillgänglig. I detta fall länkanalys också användas. Funktionell kloning å andra sidan används lättare i organismer såsom bakteriella patogener som är livsdugliga men icke odlingsbara och där sekvensdata inte är tillgängliga men genhomologi eller proteinfunktion fortfarande är av intresse.

Ett sätt att skilja på funktionell och positionell kloning är att visualisera gener som ord. Funktionell kloning är som att använda en synonymordbok för att slå upp ord och välja nya ord som har samma betydelser (eller funktioner). Positionell kloning är mer som att välja en specifik sida i en ordbok och sedan bläddra bara på den sidan efter ord av intresse.

Beräkningsmässigt bestämma homologi

Med tillkomsten av sekvenseringsteknologi blir billigare och billigare, är det nu mer genomförbart att sekvensera ett okänt genom och sedan beräkningsmässigt bestämma homologi istället för screening. Detta ger den extra fördelen av att kunna screena för flera gener av intresse samtidigt och minskar experimentell tid. Det gör att man också kan undvika arbetsintensiva kloningsprocedurer. Men om den här vägen tas, finns det andra fördomar och hinder man måste överväga. Genom att använda sekvenserade data kan man screena baserat på enbart homologi. Ett funktionsbaserat tillvägagångssätt möjliggör således upptäckt av nya enzymer vars funktioner inte skulle ha förutspåtts baserat på enbart DNA-sekvens. Därför, även om sekvensering är mindre arbetsintensiv experimentellt, kan den också leda till missade gener av intresse på grund av olika sekvenshomologi i gener med besläktad funktion.

Gibson montering

Gibson assembly är en snabb kloningsmetod som använder tre primära enzymer; 5' exonukleas , polymeras och ligas . Exonukleaset smälter 5'-änden av DNA-fragment och lämnar ett 3'-överhäng. Om det finns signifikant homologi (20-40 bp) på varje ände av DNA-insättningen kan den hybridisera med en komplementär ryggrad. Efteråt kan polymeraset fylla i luckorna medan ligas smälter ihop hacken i slutet. Denna metod ökar kraftigt kloningshastigheten och framgångshastigheten för kloning in i en vektorryggrad. Det kräver emellertid att DNA-fragmentet har signifikant homologi med plasmiden. Av denna anledning måste kunskap om sekvensen som klonas vara känd i förväg. Detta är inte ett krav med funktionell kloning.

TOPO-kloning

TOPO Cloning är en kloningsmetod som använder Taq-polymeras . Detta beror på att Taq lämnar ett enda adenosinöverhäng på 3'-änden av PCR- reaktionsprodukter. Genom att använda denna kunskap kan ryggrader med ett 5' tyminöverhäng användas för kloningsändamål. I detta fall måste kunskap om fragmentet som klonas vara känd för att kunna göra PCR-primrar för det och antalet TOPO-kloningskompatibla vektorer är relativt litet. Det ger dock fördelen att reaktioner bara tar cirka 5 minuter att göra.

Gateway-rekombinationskloning

Gateway-rekombinationskloning är en kloningsmetod där ett DNA-fragment flyttas från en plasmidryggrad till en annan via en enda homolog rekombinationshändelse . Men för att denna metod ska fungera måste DNA-fragmentet av intresse flankeras av rekombinationsställen. Även om denna metod inte är strikt ett alternativ, tillåter den förflyttning av DNA-fragment från en plasmid till en annan snabbare än att skapa ett helt nytt genomiskt bibliotek. Anledningen till att denna metod kan användas i samband med funktionell kloning är att placera ett bibliotek under en annan promotor eller på en ryggrad med en annan selektionsmarkör. Detta kan vara praktiskt om en individ vill prova funktionell kloning i ett brett spektrum av bakterier för att försöka bekämpa problemet med kodonbias .

Ansökningar

Bestämma homologi i miljön

Metagenomics är ett av de största områdena som vanligtvis använder funktionell kloning. Metagenomics studerar allt genetiskt material från ett specifikt miljöprov, såsom tarmmikrobiomet eller sjövatten. Funktionella bibliotek skapas som innehåller DNA-fragment från omgivningen. Eftersom den ursprungliga bakterien som en DNA-sekvens härstammar från inte lätt kan upptäckas, har det fördelar att skapa metagenomiska funktionella bibliotek. Mindre än 1 % av alla bakterier odlas lätt i labbet, vilket gör att en stor andel bakterier inte kan odlas. Genom att använda funktionella bibliotek kan genfunktionerna hos oodlingsbara bakterier fortfarande studeras. Dessutom utgör dessa oodlade mikrober en källa för upptäckten av nya enzymer med biotekniska tillämpningar. Några nya proteiner som har upptäckts från marina miljöer inkluderar enzymer som proteaser, amylaser, lipaser, kitinaser, deoxiribonukleaser och fosfataser.

Bestämning av homologi i en känd art

Det finns situationer där det är absolut nödvändigt att avgöra om en genhomolog från en källa finns i en annan organism. Till exempel identifiering av nya DNA-polymeraser för polymeraskedjereaktioner (PCR) som syntetiserar DNA-molekyler från deoxiribonukleotider. Medan humant polymeras fungerar optimalt vid 37 °C (98,6 °F), denatureras DNA inte förrän vid 94–98 °C (201–208 °F). Detta utgör ett problem eftersom det humana DNA-polymeraset vid dessa temperaturer skulle denaturera under denatureringssteget av PCR-reaktionen, vilket resulterar i ett icke-fungerande polymerasprotein och en misslyckad PCR. För att bekämpa detta kan ett DNA-polymeras från en termofil , eller bakterier som växer vid höga temperaturer, användas. Ett exempel är Taq-polymeras som kommer från den termofila bakterien Thermus aquaticus . Man skulle kunna sätta upp en funktionell kloningsskärm för att hitta homologa polymeraser som har den extra fördelen att de är termostabila vid höga temperaturer.

Med detta i åtanke upptäcktes 3173 Polymerase, ett annat polymerasenzym, som nu vanligtvis används i RT-PCR- reaktioner med användning av ovanstående teori. I RT-PCR-reaktioner används vanligtvis två separata enzymer. Den första är ett retroviralt omvänt transkriptas för att omvandla RNA till cDNA . Den andra är ett termostabilt DNA-polymeras för att amplifiera målsekvensen. 3173 Polymerase kan utföra båda enzymatiska funktionerna vilket resulterar i ett bättre alternativ för RT-PCR. Enzymet upptäcktes med hjälp av funktionell kloning från en viral värd som ursprungligen hittades i Octopus varma källor (93 °C) i Yellowstone National Park.

Tillämpningar för människors hälsa

En av de pågående utmaningarna med att behandla bakterieinfektioner är antibiotikaresistens som vanligtvis uppstår när patienter inte tar sin fulla behandling av medicin och därmed låter bakterier utveckla resistens mot antibiotika över tid. För att förstå hur man bekämpar antibiotikaresistens är det viktigt att förstå hur bakteriegenomet utvecklas och förändras hos friska individer utan att nyligen använda antibiotika för att ge en baslinje. Med användning av en funktionell kloningsbaserad teknik klonades DNA isolerat från human mikroflora in i expressionsvektorer i Escherichia coli . Efteråt applicerades antibiotika som skärm. Om en plasmid innehöll en geninsättning som gav antibiotikaresistens överlevde cellen och valdes ut på plattan. Om insatsen inte gav något motstånd dog cellen och bildade inte en koloni. Baserat på urval av cellkolonier som överlevde, slogs en bättre bild av genetiska faktorer som bidrar till antibiotikaresistens ihop. De flesta av de resistensgener som identifierades var tidigare okända. Genom att använda en funktionell kloningsbaserad teknik kan man belysa gener som ger upphov till antibiotikaresistens för att bättre förstå behandlingen av bakteriella infektioner.

Se även

• cDNA-bibliotek
• Genetisk skärm
• Genomiskt bibliotek
• Hybridiseringssond
• Molekylär kloning

externa länkar

• Funktionell kloning, sortering och uttrycksprofilering av nukleinsyrabindande proteiner Genome Research.com
• En ny strategi för funktionell kloning av enzymer med hjälp av filamentös fagdisplay: fallet med nukleotidyltransferaser Oxford Journals]
• Molecular genetics of Cohen syndrome Institutionen för medicinsk genetik, Helsingfors universitet