TOPO-kloning

Topoisomeras-baserad kloning (TOPO-kloning) är en molekylärbiologisk teknik där DNA- fragment klonas in i specifika vektorer utan krav på DNA-ligas . Taq-polymeras har en icke-templat-beroende terminal transferasaktivitet som adderar en enda deoxiadenosin (A) till 3'-änden av PCR-produkterna. Denna egenskap utnyttjas vid TOPO TA-kloning med "sticky end". För "trubbiga ändar" TOPO-kloning har inte mottagarvektorn överhäng och trubbiga DNA-fragment kan klonas.

Princip

Tekniken utnyttjar den inneboende biologiska aktiviteten hos DNA-topoisomeras I. Den biologiska rollen för topoisomeras är att klyva och åter sammanfoga supercoiled DNA-ändar för att underlätta replikation. Vacciniavirus topoisomeras I känner specifikt igen DNA-sekvensen 5'-(C/T)CCTT-3'. Under replikering smälter enzymet DNA specifikt vid denna sekvens, lindar upp DNA:t och omligerar det igen vid 3'-fosfatgruppen i tymidinbasen .

Vektorerna i kommersiellt tillgängliga TOPO-kit har lagts till topoisomerasstället inbäddat i en beta-galaktosidaskassett som tillåter blå-vit skanning. Vektorn slutar således självmonterande, vilket resulterar i produktion av blå kolonier som inte behöver selekteras och sekvenseras för potentiella positiva kloner.

"Sticky end" TOPO TA kloning

TOPO-vektorer är utformade på ett sådant sätt att de bär denna specifika sekvens 5'-(C/T)CCTT-3' vid de två linjära ändarna. Det linjära vektor-DNA:t har redan topoisomerasenzymet kovalent fäst vid båda strängarnas fria 3'-ändar. Detta blandas sedan med PCR-produkter. När de fria 5'-ändarna av PCR-produktsträngarna fäster vid topoisomerasets 3'-ände av varje vektorsträng, är strängarna kovalent kopplade av det redan bundna topoisomeraset. Denna reaktion fortskrider effektivt när denna lösning inkuberas vid rumstemperatur med det erforderliga saltet. Olika typer av vektorer används för att klona fragment som amplifierats av antingen Taq- eller Pfu-polymeras eftersom Taq-polymeras (till skillnad från Pfu) lämnar en extra "A"-nukleotid vid 3'-änden under amplifiering.

TA TOPO-kloningstekniken bygger på förmågan hos adenin (A) och tymin (T) (komplementära baspar) på olika DNA-fragment att hybridisera och, i närvaro av ligas eller topoisomeras, bindas samman. Insertionen skapas med PCR med användning av Taq DNA-polymeras, ett polymeras som saknar 3'- till 5'-korrekturläsningsaktivitet och som med stor sannolikhet lägger till ett enda 3'-adeninöverhäng till varje ände av PCR-produkten. Det är bäst om PCR-primrarna har guaniner i 5'-änden eftersom detta maximerar sannolikheten för att Taq DNA-polymeras adderar det terminala adenosinöverhänget. Termostabila polymeraser som innehåller omfattande 3' till 5' exonukleasaktivitet bör inte användas eftersom de inte lämnar 3' adeninöverhängen. Målvektorn linjäriseras och skärs med ett trubbigt restriktionsenzym. Denna vektor svansas sedan med dideoxitymidintrifosfat (ddTTP) med användning av terminalt transferas. Det är viktigt att använda ddTTP för att säkerställa tillsatsen av endast en T-rest. Denna svans lämnar vektorn med en enda 3'-överhängande tyminrest på varje trubbig ände.

"Blunt end" TOPO-kloning

Polymeraser (såsom Phusion) eller restriktionsenzymer som producerar trubbiga ändar kan också användas för TOPO-kloning. Istället för att förlita sig på klibbiga ändar har den trubbiga TOPO-vektorn trubbiga ändar där topoisomerasmolekylerna är bundna. Kommersiella kit, som Zero Blunt® Cloning Kit från Invitrogen, finns tillgängliga.