Fläcktest (lav)

Ett fläcktest i lichenologi är en fläckanalys som används för att identifiera lavar . Det utförs genom att placera en droppe av en kemikalie på olika delar av laven och notera färgförändringen (eller avsaknaden av sådan) i samband med appliceringen av kemikalien. Testerna påträffas rutinmässigt i dikotoma nycklar för lavarter, och de drar fördel av det breda utbudet av lavprodukter som produceras av lavar och deras unika bland taxa . Som sådan avslöjar fläcktester närvaron eller frånvaron av kemikalier i olika delar av en lav. De föreslogs först av botanikern William Nylander 1866.

Tre vanliga fläcktester använder antingen 10 % vattenhaltig KOH- lösning (K-test), mättad vattenlösning av blekpulver eller kalciumhypoklorit (C-test), eller 5 % alkoholisk p - fenylendiaminlösning (P-test). Färgförändringarna uppstår på grund av närvaron av särskilda sekundära metaboliter i laven. Det finns flera andra mindre frekvent använda punkttester av mer begränsad användning som används i specifika situationer, till exempel för att skilja mellan vissa arter.

Tester

Fläcktest på bladlaven Punctelia borreri som visar tallus (överst) och medulla (nederst) . Den rosa-röda färgförändringen av märgen i C- och KC-testerna indikerar närvaron av gyroforsyra , en kemisk egenskap som hjälper till att skilja den från liknande arter i samma släkte.

Fyra fläcktester används oftast för att hjälpa till med lavidentifiering.

K-test

Reagenset för K-testet är en vattenlösning av kaliumhydroxid (KOH) (10–25 %), eller, i frånvaro av KOH, en 10 % vattenlösning av natriumhydroxid (NaOH, lut), vilket ger nästan identiska resultat . En 10% lösning av KOH kommer att behålla sin effektivitet i cirka 6 månader till ett år. Testet beror på saltbildning och krävde närvaron av minst en sur funktionell grupp i molekylen. Lavföreningar som innehåller en kinon som en del av sin struktur ger en mörkröd till violett färg. Exempel på föreningar inkluderar pigmenten som är antrakinoner , naftokinoner och terfenylkinoner . Gula till röda färger produceras med K-testet och vissa depsider (inklusive atranorin och tamnolsyra ), och många β- orcinol depsidoner . Däremot xantoner , pulvinsyraderivat och usninsyra ingen reaktion.

C-test

Detta test använder en mättad lösning av kalciumhypoklorit (blekningspulver), eller alternativt en utspädd lösning (5,25 % används vanligtvis) av natriumhypoklorit , eller outspädd hushållsblekmedel . Dessa lösningar byts vanligtvis ut dagligen eftersom de går sönder inom 24–48 timmar; de bryts ner ännu snabbare när de utsätts för solljus (mindre än en timme) och rekommenderas därför att förvaras i en mörkfärgad flaska. Andra faktorer som påskyndar nedbrytningen av dessa lösningar är värme, luftfuktighet och koldioxid .

Färger som vanligtvis observeras med C-testet är röda och orange-rosa. Kemikalier som orsakar en röd reaktion inkluderar anziainsyra , erytrin och lecanoric acid , medan de som resulterar i orange-röd inkluderar gyroforsyra. Sällan produceras en smaragdgrön färg, orsakad av reaktion med dihydroxidibensofuraner, såsom kemikalien strepsilin .

P test

Detta är också känt som PD-testet. Den använder en 1–5 % etanollösning av para-fenylendiamin (PD), gjord genom att placera en droppe etanol (70–95 %) över några kristaller av kemikalien; detta ger en instabil, ljuskänslig lösning som håller i ungefär ett dygn. En alternativ form av denna lösning, kallad Steiners lösning, håller mycket längre även om den ger mindre intensiva färgreaktioner. Det framställs vanligtvis genom att lösa 1 gram PD, 10 gram natriumsulfit och 0,5 milliliter tvättmedel i 100 milliliter vatten; initialt rosa till färgen, lösningen blir lila med åldern. Steiners lösning kommer att hålla i månader. Fenylendiaminen reagerar med aldehyder för att ge Schiff-baser enligt följande reaktion:

R−CHO + H2N _{− C6H4} − _NH2 → _{R −} CH ₌ N − _{C6H4 −} NH2 + H2O

Produkter av denna reaktion har en gul till röd färg. De flesta β-orcinoldepsidoner och vissa β-orcinoldepsider kommer att reagera positivt. PD är giftigt både som pulver och lösning, och ytor som kommer i kontakt med det (inklusive hud) kommer att missfärgas.

KC test

Detta fläcktest kan utföras genom att väta tallus med K följt omedelbart av C. Den initiala appliceringen av K bryter ner (via hydrolys ) esterbindningar i depsider och depsidoner. Om en fenolisk hydroxylgrupp frigörs som är meta till en annan hydroxyl, så bildas en röd till orange färg när C appliceras. Alektoronsyra och fysodinsyra producerar denna färg, medan en violett färg uppstår när pikroliensyra är närvarande. CK-testet är en mindre vanligt förekommande variant som vänder på ordningen för appliceringen av kemikalier. Det används i speciella fall när man testar för orange färg producerad av barbatinsyra eller diffraktainsyra , som finns i Cladonia floerkeana . Lugols jod är ett annat reagens som kan vara användbart för att identifiera vissa arter.

Mindre vanliga tester

Det finns flera fläcktester som används sällan på grund av deras begränsade tillämpbarhet, men som kan vara användbara i situationer där speciella lavmetaboliter behöver detekteras, eller för att skilja mellan vissa arter när andra tester är negativa.

• En 10 % lösning av bariumhydroxid (Ba(OH) ₂ ) ger en violett färg när den testas med diploschistesinsyra, en kemikalie som finns i vissa Diploschistes -arter.
• En mättad lösning av bariumperoxid (BaO ₂ ), när den testas med olivetorinsyra, får en gul färg som blir grön efter några minuter.
• En 1 % (vikt per volym) lösning av järnklorid (FeCl ₃ ) i etanol ger flera möjliga färger när den testas med föreningar som har fenolgrupper.
• N-testet använder en 35% lösning av salpetersyra , som kan användas för att skilja arter av Melanelia från bruna arter av Xanthoparmelia .
• S-testet använder en svavelsyralösning (0,5 % till 10 %) borstad över ett acetonextraherat , torkat prov från en lavtalus, följt av upphettning över en låga i 30 sekunder eller tills färg utvecklas. En ihållande violett till ljusrosa färg indikerar närvaron av miriquidic syra och kan användas för att skilja mellan de två morfologiskt lika snölavarna , Stereocaulon alpinum och S. groenlandicum utan att behöva ta till mer mödosam kemisk analys.
• Beilstein -testet innebär uppvärmning av ett litet prov av ämnet som ska testas på en koppartråd ; halogenerade föreningar orsakar en tillfällig djupgrön flamfärg.

Utföra punkttester

Kemiska fläcktester på skorpan och saxicolous laven Aspicilia epiglypta

Punkttester utförs genom att placera en liten mängd av det önskade reagenset på den del av laven som ska testas. Ofta testas både cortex och medulla av laven, och ibland är det användbart att testa andra strukturer som soralia . En metod är att dra upp en liten mängd av kemikalien i en glaskapillär och röra den med laven thallus; en liten pensel används också för detta ändamål. Reaktioner visualiseras bäst med en handlins eller ett stereomikroskop . Ett rakblad kan användas för att ta bort cortex och komma åt medulla. Alternativt kan lösningen appliceras på lavfunktioner som saknar cortex eller som lämnar märgen exponerad, såsom soralia, pseudocyphellae eller undersidan av squamules.

I en variant av denna teknik, som föreslagits av den svenske kemisten Johan Santesson, används en bit filterpapper för att försöka göra färgreaktionen lättare att observera. Lavfragmentet pressas på papperet och lavämnen extraheras med 10–20 droppar aceton. Efter avdunstning av acetonet lämnas lavämnena på papperet i en ring runt lavfragmentet. Filterpapperet kan sedan punkttestas på vanligt sätt. I de fall då resultatet av ett fläcktest på tallus är osäkra, är det möjligt att pressa en tunn del av vävnaden på ett objektglas i en minimal mängd vatten och reagens under ett täckglas. En färgförändring är synlig under ett lågeffektmikroskopobjektiv eller när objektglaset placeras mot en vit bakgrund . Denna teknik är användbar när du testar lavar med mörka pigment, som Bryoria .

Punkttester kan användas individuellt eller i kombination. Resultaten av ett punkttest representeras vanligtvis med en kort kod som inkluderar, i ordningsföljd, (1) en bokstav som anger vilket reagens som används, (2) ett "+" eller "−" tecken som indikerar en färgförändring eller brist på färgförändring , respektive, och (3) en bokstav eller ett ord som indikerar den observerade färgen. Dessutom bör man vara noga med att ange vilken del av laven som testats. Till exempel betyder "Cortex K+ orange, C−, P−" att cortexen på testprovet blev orange med applicering av KOH och inte förändrades under blekmedel eller para -fenylendiamin. På liknande sätt skulle "Medulla K−, KC+R" indikera att medulla av laven var okänslig för applicering av KOH, men applicering av KOH följt omedelbart av blekmedel gjorde att märgen blev röd.

Ibland tar det lite tid för färgreaktionen att utvecklas. Till exempel, i vissa Cladonia -arter, kan PD-reaktionen med fumarprotocetraric acid ta upp till en halv minut. Däremot är reaktionerna med C och KC vanligtvis flyktiga och inträffar inom en sekund efter applicering av reagenset, så en färgförändring kan lätt missas. Det finns flera möjliga orsaker till att ett förväntat testresultat inte uppstår. Orsakerna inkluderar gamla och kemiskt inaktiva reagenser och låga koncentrationer av lavsubstanser i provet. Om färgen på tallus är mörk kan en färgförändring döljas, och andra tekniker är mer lämpliga, som filterpapperstekniken.

Andra tester

UV-belyst tallus och apothecia av kräftlaven Ochrolechia africana ; den gulaktiga färgen härrör från fluorescensen av lichexanton.

Det kan ibland vara användbart att utföra andra diagnostiska åtgärder utöver pricktest. Till exempel fluorescerar vissa lavmetaboliter under ultraviolett strålning så att exponering av vissa delar av laven för en UV-ljuskälla kan avslöja närvaron eller frånvaron av dessa metaboliter på samma sätt som fläcktester. Exempel på lavsubstanser som ger en ljus fluorescens i UV är alektoronsyra, lobarsyra och divarikatsyra samt lichexanton . I vissa fall kan UV-ljustestet användas för att hjälpa till att skilja mellan närbesläktade arter, såsom Cladonia deformis (UV−) och Cladonia sulphurina (UV+, på grund av förekomst av skivepitelsyra). Endast långvågig UV är användbar för att observera lavar direkt.

Mer avancerade analytiska tekniker, såsom tunnskiktskromatografi , högpresterande vätskekromatografi och masspektrometri kan också vara användbara för att initialt karakterisera den kemiska sammansättningen av lavar eller när punkttester inte avslöjar.

Historia

Den finske lavologen William Nylander anses allmänt ha varit den första som demonstrerade användningen av kemikalier för att hjälpa till med lavidentifiering. I tidningar publicerade 1866 föreslog han fläcktester med KOH och blekpulver för att få karakteristiska färgreaktioner - typiskt gult, rött eller grönt. I dessa studier visade han till exempel att lavarna som nu är kända som Cetrelia cetrarioides och C. olivetorum kunde särskiljas som distinkta arter på grund av deras olika färgreaktioner: C+ röd i den senare, kontrasterad med ingen reaktion i den förra. Nylander visade hur KOH kunde användas för att skilja mellan lookalikes Xanthoria candelaria och Candelaria concolor eftersom närvaron av parietin i den förstnämnda arten resulterar i en stark färgreaktion. Han visste också att lavkemikalierna i vissa fall inte var jämnt fördelade i cortex och märg på grund av de olika färgreaktionerna på dessa områden. I mitten av 1930-talet Yasuhiko Asahina testet med para-phenylendiamine, som ger gula till röda reaktioner med sekundära metaboliter som har en fri aldehydgrupp. Detta fläcktest visade sig senare vara särskilt användbart i taxonomin för familjen Cladoniaceae .

Citerad litteratur

•   Ahmadjian, Vernon ; Hale, Mason E. (1973). Lavarna . New York: Academic Press. ISBN 978-0-12-044950-7 .
•   Dahl, Eilif ; Krog, Hildur (1973). Macrolichens från Danmark, Finland, Norge och Sverige . Universitetsforlaget. ISBN 9788200022626 .
•   Orange, A.; James, PW; White, FJ (2001). Mikrokemiska metoder för identifiering av lavar . British Lichen Society. ISBN 978-0-9540418-0-9 .