Antal virtuella kolonier
Virtuell koloniräkning ( VCC ) är en kinetisk mikrobiologisk analys med 96 brunnar som ursprungligen utvecklades för att mäta aktiviteten hos defensiner . Det har sedan applicerats på andra antimikrobiella peptider inklusive LL-37 . Den använder en metod för att räkna upp bakterier som kallas kvantitativ tillväxtkinetik, som jämför den tid det tar för en bakteriell batchkultur att nå en tröskel för optisk densitet med den för en serie kalibreringskurvor. Namnet VCC har också använts för att beskriva tillämpningen av kvantitativ tillväxtkinetik för att räkna upp bakterier i cellkulturinfektionsmodeller. Antimikrobiell känslighetstestning (AST) kan göras på 96-brunnars plattor genom att späda ut det antimikrobiella medlet i varierande koncentrationer i buljong inokulerad med bakterier och mäta den lägsta hämmande koncentrationen som resulterar i ingen tillväxt. Dessa metoder kan dock inte användas för att studera vissa membranaktiva antimikrobiella peptider , som hämmas av själva buljongen. Proceduren för virtuell koloniräkning drar fördel av detta faktum genom att först exponera bakterieceller för det aktiva antimikrobiella medlet i en buffert med låg salthalt i två timmar, sedan samtidigt inhibera antimikrobiell aktivitet och inducera exponentiell tillväxt genom att tillsätta buljong. Tillväxtkinetiken överlevande celler kan sedan övervakas med hjälp av en temperaturkontrollerad plattläsare . Den tid det tar för varje tillväxtkurva att nå en tröskeländring i optisk densitet omvandlas sedan till virtuella överlevnadsvärden, som fungerar som ett mått på antimikrobiell aktivitet.
Antimikrobiell känslighetstestning
Metoder har funnits för att testa den antibakteriella aktiviteten hos antimikrobiella medel i många decennier. Vanligtvis innebär dessa att bakterier exponeras för det antimikrobiella medlet i närvaro av näringsämnen som annars skulle möjliggöra robust tillväxt av bakterierna. Experiment kan antingen utföras på plattor innehållande agar som ett fast underlag, eller i flytande buljong utan agar. Många småmolekylära antibiotika utvecklades med dessa metoder. Men en komplikation uppstod när forskare ville studera den antibakteriella aktiviteten hos vissa antimikrobiella peptider, eftersom de hämmas av rika medier, oavsett om de levereras på en agarplatta eller i buljong. Till exempel är defensiner antimikrobiella peptider som är en del av det medfödda immunsystemet hos många organismer inklusive människor. De är indelade i flera strukturella klasser inklusive alfa, beta och theta, baserat på mönstret för disulfidbindning. Fyra humana alfa-defensiner finns i granulerna av neutrofilen, och dessa är kända som humana neutrofilpeptider (HNP) 1-4. Mycket tidigt i studien av defensiner upptäcktes det att HNP är starkt hämmas av fysiologiska saltkoncentrationer. För att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos HNP:er måste de inkuberas med celler i en buffert med låg salthalt som ett separat initialt steg, innan rik media tillsattes för att kunna räkna upp överlevande. Eftersom det inte finns något sätt att analysera peptider såsom defensin HNP1 i närvaro av fysiologiskt relevanta saltkoncentrationer, använder varje analys som mäter HNP1-aktivitet förhållanden som skiljer sig från de som finns i kroppen.
Traditionell koloniräkning
En metod som vanligtvis används för att mäta antimikrobiell aktivitet i vätska är att exponera det antimikrobiella medlet för celler under en inkubationstid som två timmar, och sedan räkna upp överlevande genom att späda blandningen och sedan sprida en del av vätskan på en agarplatta som innehåller rik media . Inkubationssteget görs vanligtvis på en platta med 96 brunnar. Efter spridning inkuberas agarplattorna sedan över natten och antalet kolonibildande enheter (CFU) räknas nästa dag. Dessa förfaranden har ett antal nackdelar inklusive felaktigheter som introducerades i utspädningssteget och möjligheten att ett stort antal agarplattor skulle krävas för att producera ett acceptabelt antal kolonier per platta. Observera att för att mäta den antimikrobiella aktiviteten hos antimikrobiella medel såsom defensiner, skulle inkubationssteget på två timmar utföras i en buffert med låg salthalt såsom 10 mM natriumfosfat pH 7,4.
Minsta hämmande koncentration
En annan metod som vanligtvis används för att mäta antimikrobiell aktivitet i vätska är att exponera utspädningsserier av det antimikrobiella medlet för celler i rik buljong såsom Mueller-Hinton-buljong (MHB) i en 96-brunnars platta, och sedan inkubera 96-brunnars plattan vid 37 °C över natten. Varje brunn blir antingen grumlig av bakterietillväxt eller förblir klar. Den minsta hämmande koncentrationen (MIC) rapporteras sedan som den lägsta koncentrationen som ger en klar brunn och därmed hämmar tillväxten. Standardiserade MIC-metoder som använder MHB är inte tillämpliga på antimikrobiella medel såsom defensiner, eftersom defensiner måste inkuberas i en buffert med låg salthalt, inte rik buljong, för att mäta deras aktivitet.
Antal virtuella kolonier
Den traditionella koloniräkningsmetoden kan modifieras för att mäta antimikrobiell aktivitet i 96-brunnars plattan utan behov av provtagning av brunnarna och spridning av överlevande celler på agarplattor genom att helt enkelt tillsätta en lika stor volym av två gånger koncentrerad buljong efter två timmars inkubation i låg saltbuffert. Det skulle behöva finnas ett sätt att avgöra hur många celler som överlevde i slutet av inkubationsperioden med hjälp av satskulturer. Lyckligtvis erbjuder matematiken för exponentiell tillväxt ett sätt att göra just det. Om grumligheten, eller den optiska densiteten, för satskulturerna i 96-brunnars plattan övervakas i realtid, och den tid som krävs för en brunn att nå ett tröskelvärde registreras, och fördubblingstiden för de exponentiellt växande cellerna är kända, då kan antalet celler som ursprungligen fanns i inokulum beräknas. Detta startantal av celler är lika med antalet överlevande celler vid slutet av två timmars inkubation med det antimikrobiella medlet. Eftersom denna procedur inte kräver någon egentlig kolonibildning eller koloniräkning, kallas den "virtuell koloniräkning". Hittills har VCC-tekniken begränsats till antimikrobiella peptider. Det kan potentiellt fungera med andra antimikrobiella medel, så länge som den två gånger koncentrerade Mueller Hinton-buljongen inaktiverar medlets antimikrobiella aktivitet. VCC-metoden kan detektera antingen bakteriedödande eller bakteriostatisk aktivitet, men den kan inte skilja mellan dem. Bakteriostatisk aktivitet kan dock kvantifieras genom att mäta skillnaden i tröskeltider mellan "input" och "output" kontroller (se nedan).
Allmän laboratorieprocedur för användning i VCC-analyser
0 En 2 mL bakteriekultur inokuleras från en enda koloni och odlas över natten i Phosphate Mueller Hinton (PMH) eller Phosphate Mueller Hinton Tryptic Soy Broth (PMHT) media. PMH är en 1:1 blandning av Mueller Hinton Broth och 10 mM natriumfosfat pH 7,4. Antingen katjonjusterad eller icke-katjonjusterad MHB kan användas. I vissa experiment fanns 1 % tryptisk sojabuljong (TSB) närvarande i fosfatbufferten för att öka defensinaktiviteten under två timmars inkubation; i detta fall innehöll den analoga 1:1-blandningen av buffert och buljong 0,5 % TSB och kallas PMHT. 250 μl av denna kultur överförs till 25 mL PMH i en 125 mL engångsfilterkolv. Denna kultur odlas vid 37 ° C skakning 250 rpm vanligtvis 2–3 timmar tills den optiska densiteten för kulturen vid 650 nm är mellan 0,45 och 0,55. Under tiden späds antimikrobiella peptider på en 96-brunnars platta (Costar 3595, som är vävnadsodlingsbehandlade) i 10 mM natriumfosfat pH 7,4 så att den slutliga volymen är 90 mikroliter. Virtuella kolonibildande enheter, eller CFUv, definieras i den ursprungliga VCC-publikationen och dess definition upprepas här: CFUv hölls konstant bland de sex testade stammarna så att grumligheten, och därmed mängden cellmembran, i varje experiment var ungefär lika stor . Eftersom CFUv standardiserades till CFU av Escherichia coli ATCC 25922, kan CFU, inte CFUv, rapporteras med denna stam. För den experimentella delen av analysen späds celler i 10 mM natriumfosfat pH 7,4 så att den slutliga cellkoncentrationen i 10 mikroliter är 5x10^ CFUv /ml. 10 μl av denna cellsuspension pipetteras under de 90 μl antimikrobiella peptiderna i lösning, vilket resulterar i en cellsuspension vid standardympningen på 5x10 5 CFUv/ml under exponeringen av celler för antimikrobiella peptider. Flera brunnar på plattan med 96 brunnar används för kontroller som inte exponerats för något antimikrobiellt medel; dessa kallas "output"-kontroller. Plattan med 96 brunnar inkuberades sedan två timmar i plattläsaren, ställdes in för att skaka och ta avläsningar var femte minut. Under denna inkubationstid hölls frökulturen på is. För en kalibreringskurva sattes 1 ml frökultur till 1,5 ml PMH efter två timmars inkubation för att generera en suspension av 108 CFUv /ml. En 10-faldig spädningsserie av denna suspension gjordes från 10 7 till 10 CFUv/ml i 200 μl total volym PMH, som upptog åtta brunnar på plattan med 96 brunnar. Vid denna tidpunkt sattes celler exponerade för inget antimikrobiellt medel till flera brunnar på plattan från kulturen som hölls på is; dessa kallas "input"-kontroller, eftersom de indikerar antalet celler närvarande vid början av den två timmar långa inkubationen. I de initialt publicerade VCC-experimenten användes endast de inre 60 brunnarna på plattan, eftersom avdunstning ändrade volymen på kantbrunnarna under den 12 timmar långa inkubationen. Emellertid kan alla 96 brunnar i 96-brunnars plattan användas för experimentet så länge som kanten på plattan är inlindad med en bit Parafilm M sex rutor långa och en halv kvadrat breda. Den gasgenomsläppliga parafilmen fördröjer avdunstning samtidigt som den tillåter cellandning och förhindrar att partiklar blåses in i plattan med 96 brunnar i plattläsaren. När plattan väl är inslagen med Parafilm överförs den från biosäkerhetsskåpet till tallriksläsaren. Flera modeller av temperaturkontrollerade plattläsare har framgångsrikt använts i VCC-analyser, inklusive en Molecular Devices Vmax som hålls i ett varmt rum, en Molecular Devices Spectramax och en Tecan Infinite M1000. Plattläsaren är inställd att läsa av optisk densitet vid 650 nm var 5:e minut under 12 timmar, skakning före varje avläsning. Rådata importeras till Microsoft Excel, där makrot VCC Calculate körs för att bestämma den tid som krävs för att varje tillväxtkurva ska nå en tröskel för optisk densitet på 0,02.
Kvantitativ tillväxtkinetik
_sextuplicate_calibration_growth_curves.png)
Metoden för uppräkning av överlevande celler som används av VCC kallas kvantitativ tillväxtkinetik (QGK). Den relaterar den kinetiska tiden det tar för grumligheten av en mikrobiologisk satsvis bakteriekultur i en brunn i en mikroplatta med 96 brunnar att nå en tröskelskillnad i grumlighet till en 10-faldig utspädningsserie av kalibreringstillväxtkurvor.
Kvantifiering av antalet livsdugliga celler görs med en process som är matematiskt identisk med kvantitativ realtidspolymeraskedjereaktion (QPCR), förutom med QGK- celler , snarare än kopior av PCR-produkter, växer exponentiellt. Tiden det tar att nå tröskeln kallas "tröskeltiden", Tt, vilket är ekvivalent med QPCR- värdet "cykeltid" eller Ct .
Det finns minst fem processer som orsakar förseningar i tröskeltider i VCC-analyser:
- Vidhäftning, vilket gör att celler fastnar på mikroplattan och eventuellt bildar biofilmer . Såvida inte dessa celler råkar vara direkt i ljusbanan, kommer deras tillväxt inte att påverka avläsningar av optisk densitet.
- Kohesion, vilket får celler att aggregera till klumpar av olika storlekar istället för en homogen suspension av individuella celler som genomgår binär fission . Sammanhållning kan orsaka oprecision och fluktuationer i T t . Kohesiva klumpar kan också vara vidhäftande, vilket leder till både oprecision på grund av kohesion och felaktighet (ökad T t ) på grund av vidhäftning.
- Bakteriostatisk aktivitet, vilket gör att celler inte kan komma in i exponentiell tillväxt trots att de inte dödas. Övergående bakteriostatisk aktivitet kan orsaka fördröjningstider, vilket ökar T t .
- Den metaboliska eftersläpningsfasen av bakterietillväxt . En sådan fördröjningsfas skulle förväntas inträffa i analysen eftersom celler som växer långsamt eller inte alls under den initiala exponeringen för antimikrobiella peptider i bufferten med låg salthalt skiftas till exponentiell tillväxt vid tillsats av två gånger koncentrerade rika medier. Om denna metaboliska eftersläpningsfas ökar i närvaro av den antimikrobiella peptiden kan den betraktas som en form av övergående bakteriostatisk aktivitet i kategori 3 ovan, även om andra källor till övergående bakteriostatisk aktivitet, såsom en fördröjning på grund av den tid som krävs för reparationen av skadade cellstrukturer såsom cellväggar eller cellmembran , är möjliga.
- Baktericid aktivitet, eller dödande. Färre överlevande celler orsakar en fördröjning av T t eftersom de överlevande tar längre tid att producera samma mängd grumlighet genom exponentiell tillväxt. Om alla andra processer som orsakar ökningar av T t är försumbara, blir VCC-analysen en bakteriedödande analys och T t kan användas för att räkna upp livsdugliga bakterier med QGK. I detta förenklade fall är VCC-resultaten "virtuell överlevnad" ekvivalenta med "överlevnads"-resultaten från en traditionell bakteriedödande analys av koloniantal.
Bakterie
VCC användes initialt för att kvantifiera den antibakteriella aktiviteten av peptider mot sex stammar av Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus och Enterobacter aerogenes . Vanligtvis jämförs en standard Gram-negativ och Gram-positiv kvalitetskontrollstam . Escherichia coli ATCC 25922 och Staphylococcus aureus ATCC 29213 har använts som standard Gram-negativa respektive Gram-positiva stammar. VCC har också applicerats på Bacillus anthracis , det orsakande medlet för mjältbrand . Dessutom har VCC applicerats på Salmonella enterica serovar Typhimurium och Acinetobacter baumannii .
Antimikrobiella peptider
Den initiala studien av virtuell koloniräkning mätte aktiviteten av alla sex humana alfa-defensiner samtidigt på samma platta med 96 brunnar: HNP1 , HNP2 , HNP3 , HNP4 , HD5 och HD6 . Därefter studerades muterade former av några av dessa sex defensiner av VCC. Ett konserverat glycin i en beta-bulge i HNP2 ersattes med en serie D-aminosyror vilket resulterade i VCC-aktivitet proportionell mot sidokedjehydrofobicitet och laddning. VCC visade att N-terminalt acetylerad och/eller C-terminalt amiderad HNP2-aktivitet är proportionell mot elektrostatisk laddning. VCC-resultaten var återigen proportionella mot laddningen för en serie saltbryggor som stör mutanter, vilket tyder på att saltbryggan inte krävs för HNP2-funktion. VCC mätte vikten av N-terminala naturliga och artificiella pro-segment av propeptiden HNP1 , vilket dramatiskt förändrade aktiviteten mot Escherichia coli och Staphylococcus aureus . Enantiomerformer av HNP1, HNP4, HD5 och Beta-defensin 2 helt sammansatta av D-aminosyror antydde olika mekanismer för defensinaktivitet mot Gram-positiva och Gram-negativa bakterier. VCC-resultat av dimeriseringsförsvagade monomerer och bundna dimerformer av HNP1 visade vikten av dimerisering . Att ersätta det konserverade glycinet med L- alanin resulterade i subtila VCC-skillnader. Omfattande alaninskanningsmutagenes av HNP1 och HD5 visade vikten av skrymmande hydrofoba rester . HD5-disulfidreduktion försämrade VCC-aktivitet men ökade lipopolysackaridbindningsaktivitet mot tre gramnegativa stammar. HD5-varianter med en disulfidbindning eller inga disulfidbindningar uppvisade kraftigt minskad VCC-aktivitet mot A. baumannii , medan ett förenklat derivat av HD5 konstruerat genom disulfidreduktion och argininintroduktion visade potent aktivitet mot en multiläkemedelsresistent stam av A. baumannii . Dessa studier har utökats till att inkludera ytterligare beta-defensiner , teta-defensiner och det humana katelicidinet LL-37 och relaterade peptider.
Inokulumeffekt
En ympeffekt har tidigare beskrivits för många antimikrobiella medel, så att medlet är mindre effektivt när fler bakterier läggs till analysen. Denna effekt observeras ofta med betalaktamer när de analyseras mot betalaktamasproducerande bakterier. Ympeffekten var potentiellt relevant för en studie av HNP1, pro LL-37 och LL-37 som inkluderade både traditionell koloniräkning och VCC sida vid sida. I den rapporten fann man att traditionella koloniantal överlevnadsvärden var lägre än virtuella överlevnadsvärden för alla testade peptider och stammar. Eftersom inokulumet av bakterier var 20 gånger större i VCC-analysen jämfört med det standardiserade traditionella koloniräkneprotokollet som användes, kan skillnaden ha berott på en ympeffekt, även om effekten skulle ha varit den omvända effekten av inokulumeffekten som normalt ses med andra antimikrobiella medel, eftersom det högre inokulatet visade mer aktivitet. Denna möjlighet undersöktes i en serie VCC-experiment huvudsakligen med fokus på defensinet HNP1 och bakteriestammarna E. coli, S. aureus och B. cereus . Resultaten av sex experiment visade en uttalad inokulumeffekt av HNP1 mot E. coli .
Algoritmer för att analysera kvantitativ tillväxtkinetik
Komplexa Microsoft Excel-kalkylblad som används för beräkning av virtuell överlevnad och virtuella dödliga dosvärden, och ett Visual Basic-makro som används för att beräkna tröskeltider, har publicerats.
Säker och effektiv pipetteringsteknik
VCC-användare uppmanas att överföra celler i en liten volym som 10 mikroliter under en större volym som 90 mikroliter, liknande QGK-kalibreringskurvorna som visas ovan och kalibreringskurvorna som rapporterades i den första VCC-publikationen, men till skillnad från den experimentella proceduren som används för att testa defensinaktivitet i samma tidning. Den förbättrade pipetteringstekniken beskrevs 2011 i studien av biosäkerhetsnivå 3 (BSL-3) patogenen Bacillus anthracis . Den ursprungliga metoden som publicerades 2005 innebar överföring av 50 mikroliter cellsuspension till 50 mikroliter vätska, vilket genererar skum, bubblor och grumlighet som är oförenlig med en turbidimetrisk metod när cellerna överförs direkt till botten av brunnarna under fosfatbufferten. lösningar. Att undvika detta problem genom att lägga till cellsuspensioner som droppar från ovan kan orsaka aerosoler som resulterar i korskontaminering. Bioaerosoler av farliga bakterier kan också utgöra säkerhetsrisker som kan minskas genom att utföra experiment i ett biosäkerhetsskåp .
Den här artikeln skickades till WikiJournal of Science för extern akademisk referentgranskning 2019 ( granskarrapporter ) . Det uppdaterade innehållet återintegrerades på Wikipedia-sidan under en CC-BY-SA-3.0- licens (). Den version av rekordet som granskats är: Bryan Ericksen; et al. (16 februari 2020). "Antal av virtuella kolonier" (PDF) . WikiJournal of Science . 3 (1): 3. doi : 10.15347/WJS/2020.003 . ISSN 2470-6345 . Wikidata Q86161728 .