Vectorette PCR

Steg i PCR

Vectorette PCR är en variant av polymeraskedjereaktion (PCR) designad 1988. Den ursprungliga PCR skapades och patenterades även under 1980-talet. Vectorette PCR noterades och beskrevs först i en artikel 1990 av John H. Riley och hans team. Sedan dess har flera varianter av PCR skapats. Vectorette PCR fokuserar på att amplifiera en specifik sekvens erhållen från en intern sekvens som ursprungligen är känd fram till fragmentets slut. Flera undersökningar har tagit denna metod som en möjlighet att genomföra experiment för att avslöja de potentiella användningarna som kan härledas från Vectorette PCR.

Introduktion

Vectorette PCR liknar PCR med skillnaden att den är kapabel att erhålla den önskade sekvensen för amplifiering från ett redan känt primerställe. Medan PCR behöver information om redan kända sekvenser i båda ändar, kräver Vectorette PCR endast förkunskaper om en. Detta innebär att man kan tillämpa PCR-metoden som behöver sekvensinformation från båda ändarna till fragment av DNA som innehåller informationen om sekvensen endast i ena änden och inte i den andra. För att uppnå detta finns det specifika steg som denna metod först måste gå igenom. Dessa steg har undersökts i syfte att upptäcka de vetenskapliga användningarna av Vectorette PCR och hur de kan tillämpas.

Steg

Vectorette PCR kan utveckla en strategi för att åstadkomma PCR-amplifiering som är enkelriktad. Vectorette PCR består av tre huvudsteg . Det första steget inkluderar användning av ett restriktionsenzym för att åstadkomma nedbrytning av provets DNA. Det DNA som ska användas för undersökningsändamålet måste kunna smältas av restriktionsenzymer som är lämpliga för den genen, annars kan inte DNA-fragmenten som bildar den allmänna populationen skapas. Efter att det är slutfört sammanförs ett Vectorette-bibliotek genom att ligera Vectorette-enheterna till de lämpliga DNA-fragmenten som tidigare digererades. Ligering är handlingen att binda samman två saker. En Vectorette-enhet är endast delvis inte helt dubbeltrådig med en felaktig sektion placerad i mitten av enheten. Anledningen till att den inte matchar är att hjälpa den att undvika Vectorette-primers försök att få den att genomgå första strängsyntes. Genom att göra detta undviks också all priming som är ospecifik. Denna ligering sammanför vektoretten som är dubbelsträngad och ändarna av restriktionsfragmenten som tidigare gjordes i det första steget. Genom att göra detta introduceras den kända sekvensen som används för att prima PCR-reaktionen på ena sidan medan den andra primeras på den genomiska sekvensen som redan är känd för användaren. Det tredje och sista steget har två delar. Detta beror på att det finns två primrar, den initierande primern (IP) och Vectorette-primern (VP), som verkar i olika steg. Under den första delen arbetar IP med att amplifiera primerförlängningen medan VP förblir hybridiserad med produkten; sålunda utförs ingen bakgrundsförstärkning i detta skede. Detta ändras dock under den sista och följande delen av PCR eftersom primingen som utförs kommer från både IP och VP.

Forskning

Mycket forskning har bedrivits på Vectorette PCR och dess tillämpningar inom biologin. Forskare använde Vectorette PCR för att ta transgenens flankerande DNA och isolera det. De använde denna teknik på DNA som tillhör möss som låg bredvid transgenavsnitt. Av detta kunde forskarna visa att användningen av Vectorettes kan underlätta återhämtningen och kartläggningen av sekvenser i komplexa genom . De har också funnit att Vectorette PCR kan hjälpa till vid analys av sekvenser genom subvektorjustering när PCR-produkter av stor storlek är föremålet för handen.

Annat arbete har tittat på att utveckla en metod som använder Vectorette PCR för att åstadkomma genomisk gång. Genom att använda Vectorette PCR kunde forskare förvärva enkelsträngat DNA som erhölls från PCR-produkter för att sekvensera dem. Från detta identifierades ett tillvägagångssätt i vilket amplifieringen av sekvenser som tidigare var okarakteriserade var möjlig. Denna forskning visar hur nya sekvenser snabbt kan utvecklas när endast en känd sekvens av DNA används för att starta.

Ytterligare forskning har experimenterat med skapandet av en metod som framskrider isoleringen av mikrosatellitupprepningar. Genom att använda Vectorette PCR har forskare hittat en snabb teknik för att åstadkomma detta med nya mikrosatellitupprepningar. De har försökt och lyckats använda denna teknik för att isolera en mängd av sex mikrosatellitupprepningar.

Vectorette PCR har också använts för att inte bara identifiera genomiska positioner för insättningssekvenser (IS) utan också för att kartlägga dem. Forskning om detta har belyst ett sätt att slutföra typningen av mikrobiella fläckar och identifiering och kartläggning av saker som IS-insättningsställen som finns i mikrobiella genom. Vectorette PCR visar sig vara användbar när det gäller att snabbt och enkelt kartlägga genomens IS-element.

Transposerbart element , transposon eller TE är en variation av genetiska element som kan ändra sin plats i ett genom genom en process som kallas "hoppning". TE-displayen är utformad för att presentera de olika varianterna av TE-insättningsställen som hjälper till att skapa många dominerande markörer. Ett problem som uppstod i den ursprungliga metoden var att hitta en PCR-metod som kunde vara specifik och effektiv i sin produktion av transposonet i genomet. Forskare har hittat en lösning på detta problem genom att använda Vectorette PCR som PCR-metod. Eftersom Vectorette PCR kan vara specifik med sin isolering och amplifiering av gener, hjälpte detta till med deras forskning och hjälpte till att förbättra metoden för TE-visning genom att spara både tid och kostnader. Forskarna kunde sedan producera många dominerande markörer med hjälp av Vectorette PCR som är baserad på en TE-display som är icke-radioaktiv.

Sköldkörtellymfom är en sjukdom som leder till att lymfocyterna som tillhör sköldkörteln omvandlas till celler av cancerartad karaktär. Forskare har testat en ny metod som hjälper till att diagnostisera detta tillstånd. Användningen av Vectorette PCR kombinerades med nedbrytning av restriktionsenzym, och det visade sig att Vectorette PCR visade sig vara användbart i deras studie och hjälpte till vid diagnosen av sköldkörtellymfom.

Forskare har undersökt den potentiella användningen av Vectorette PCR i undersökningen av gener för sjukdomar. De har använt två metoder, trinukleotidupprepningar som specifikt används för målsökning av transkriberade regioner och Vectorette PCR, för att erhålla enkla sekvensupprepningar eller SSR. Man tror att genetiska markörer kan göras från dessa SSR. Resultatet från denna forskning hoppas kunna hjälpa forskare att försöka härleda genetiska markörer som kan transporteras från okända genom. Vectorette PCR användes för att avslöja SSR som flankerar trinukleotidupprepningen som var mål för testning. Detta är också känt som TNR eller trinukleotid Vectorette PCR. De tror att deras TNR-metod kombinerat med amplifieringen som tillhandahålls av Vectorette PCR kan användas i eukaryoter för att skapa molekylära markörer som är baserade på enkla upprepade sekvenser. Forskarna tror också att denna metod kommer att vara värdefull när man försöker isolera gener som kan orsaka sjukdomar.

Används

Användningsområdena som har härletts från Vectorette PCR är många och har varit användbara för biologin . Det ger till exempel upphov till metoder som kan hjälpa under utbrott av sjukdomar genom att göra det lättare att subtypa patogener som är liknande eller närbesläktade. Det kan också användas för att diagnostisera vissa sjukdomar. Tidigare på denna sida noterades att Vectorette PCR kan ge upphov till flera funktioner som kan utföras på nya DNA-sekvenser som ligger nära en sekvens som redan är känd. Dessa funktioner som att isolera DNA, amplifiera det och analysera det ligger bakom användningarna för Vectorette PCR. Dessa användningsområden är saker som genomvandring, DNA-sekvensering för ändarna av artificiella jästkromosomer (YAC) och kosmidinsättningar, att kunna kartlägga introner och promotorer i genomiskt DNA och regioner med mutationer, vilket underlättar sekvenseringen av kloner av stor storlek, och fylla i de luckor som uppstår under kartläggningen av genom.

En intron är en DNA-sekvens som flankeras av exoner och därför ligger mellan dem. Det är regionen som skärs ut medan exoner uttrycks, så introner påverkar inte aminosyrornas kod. Genuttryck kan endast påverkas av ett antal intronsekvenser. Vectorette PCR har visat sig vara fördelaktigt när det gäller karakteriseringen av dessa intronsekvenser när de har visat sig ligga bredvid kända sekvenser.

cDNA eller komplementärt DNA är en DNA-sekvens som är komplementär till det RNA som är mallen vid syntetisering av DNA under omvänd transkriptasprocess. Vectorette PCR som utnyttjar de primrar som härrör från cDNA ger upphov till en metod som kan förvärva intronsekvenser som är belägna intill exoner och som hjälper till i utvecklingen av geners struktur. Det kan uppnå detta när man initierar processen med en sekvens av cDNA och en klon av ett genom.

Vectorette PCR ger också användaren en fördel än om han/hon skulle använda andra befintliga teknologier. Användaren kommer att kunna utföra uppgifter som genmanipulation som är cellfri, Vectorette PCR med minimalt material till att börja med och utföra Vectorette PCR med DNA som inte behöver vara av hög renhet. Dessa fördelar gör det möjligt för användaren att spara tid och resurser samtidigt som det ökar utbudet av DNA som kan riktas mot.

Kromosomvandring

Kromosomvandring kan användas för att klona en gen. Den gör detta genom att använda den kända genens markörer som ligger närmast och kan därför användas i tekniker som att isolera DNA-sekvenser och hjälpa till med sekvensering och kloning av DNA från organismer. Kromosomvandring är också användbart när det gäller att fylla i de luckor som kan finnas i genomen genom att lokalisera kloner som överlappar med en biblioteksklonände. Detta innebär att för att kromosomvandring ska kunna utföras krävs ett klonbibliotek av genomiskt format. Det är därför Vectorette PCR är en av metoderna som kan användas för att skapa detta bibliotek för kromosomvandring. Vectorette PCR kommer väl till pass när det är nödvändigt att erhålla de regioner som är både uppströms och nedströms och flankera en sekvens som redan är känd. Genom att erhålla dessa regioner tillhandahåller det biblioteket av ett genomiskt format som kromosomvandring kräver.

Jäst konstgjord kromosom

Yeast artificiell kromosom eller YAC är en DNA-molekyl som är utvecklad av människor för att ta DNA-sekvenserna som tillhör jästceller och klona dem. Konstgjorda kromosomer från jäst kan infogas med fragment av DNA från organismen av intresse. Jästceller kommer sedan att assimilera den artificiella jästkromosomen som innehåller DNA från organismen av intresse. Jästcellerna förökar sig sedan i antal och detta åstadkommer amplifiering av det DNA som har införlivats i det som sedan isoleras för saker som sekvensering och kartläggning av önskat DNA, dvs DNA:t som ursprungligen satts in i jästens artificiella kromosom . Vectorette PCR hjälper till med denna process genom att åstadkomma inte bara isoleringen av jästens konstgjorda kromosomers ändar utan också amplifieringen av ändarna.