Primer promenad

Primer Walking är en teknik som används för att klona en gen (t.ex. sjukdomsgen) från dess kända närmaste markörer (t.ex. känd gen). Som ett resultat används det i klonings- och sekvenseringsinsatser i växter, svampar och däggdjur med mindre förändringar. Denna teknik, även känd som "riktad sekvensering", använder en serie Sanger-sekvenseringsreaktioner för att antingen bekräfta referenssekvensen för en känd plasmid eller PCR-produkt baserat på referenssekvensen (tjänst för sekvensbekräftelse) eller för att upptäcka den okända sekvensen för en fullständig plasmid eller PCR-produkt genom att designa primers för att sekvensera överlappande sektioner (sekvensupptäcktstjänst).

Primer walking: en DNA-sekvenseringsmetod

Primerwalking är en metod för att bestämma DNA-sekvensen upp till 1,3–7,0 kb-intervallet medan kromosomvandring används för att producera klonerna av redan kända sekvenser av genen. För långa fragment kan inte sekvenseras i en enda sekvens som kan läsas med kedjeavslutningsmetoden . Denna metod fungerar genom att dela upp den långa sekvensen i flera på varandra följande korta. DNA:t av intresse kan vara en plasmidinsättning , en PCR- produkt eller ett fragment som representerar ett gap vid sekvensering av ett genom. Termen "primer walking" används där huvudsyftet är att sekvensera genomet. Termen "kromosomvandring" används istället när sekvensen är känd men det inte finns någon klon av en gen. Till exempel kan genen för en sjukdom vara lokaliserad nära en specifik markör såsom en RFLP på sekvensen. Kromosomvandring är en teknik som används för att klona en gen (t.ex. en sjukdomsgen) från dess kända närmaste markörer (t.ex. en känd gen) och används därför i måttliga modifieringar i klonings- och sekvenseringsprojekt i växter, svampar och djur. För att uttrycka det på ett annat sätt, används den för att hitta, isolera och klona en specifik sekvens som finns nära genen som ska kartläggas. Bibliotek med stora fragment, främst bakteriella konstgjorda kromosombibliotek, används mest i genomiska projekt. För att identifiera den önskade kolonin och för att välja en speciell klon screenas biblioteket först med en önskad sond. Efter screening överlappas klonen med sonden och överlappande fragment kartläggs. Dessa fragment används sedan som en ny sond (korta DNA-fragment erhållna från 3'- eller 5'-ändarna av kloner) för att identifiera andra kloner. Ett bibliotek består ungefär av 96 kloner och varje klon innehåller en annan insättning. Sond ett identifierar λ1 och λ2 eftersom det överlappar dem. Sond två härledd från λ2-kloner används för att identifiera λ3, och så vidare. Orienteringen av klonerna bestäms genom restriktionskartläggning av klonerna. Således kunde nya kromosomala regioner som finns i närheten av en gen identifieras. Kromosomvandring är tidskrävande, och kromosomlandning är den valda metoden för genidentifiering. Denna metod kräver upptäckten av en markör som är fast relaterad till mutantlokuset.

Fragmentet sekvenseras först som om det vore ett kortare fragment. Sekvensering utförs från varje ände med användning av antingen universella primers eller specifikt utformade sådana. Detta bör identifiera de första 1000 eller så baserna. För att fullständigt sekvensera regionen av intresse är design och syntes av nya primrar (komplementära till de sista 20 baserna av den kända sekvensen) nödvändig för att erhålla sammanhängande sekvensinformation.

Primer walking kontra shotgun sekvensering

Primerwalking är ett exempel på riktad sekvensering eftersom primern är designad från en känd region av DNA för att styra sekvenseringen i en specifik riktning. I motsats till riktad sekvensering är hagelgevärssekvensering av DNA en snabbare sekvenseringsstrategi.

Det finns en teknik från den "gamla tiden" för genomsekvensering. Den underliggande metoden för sekvensering är Sanger-kedjetermineringsmetoden som kan ha läslängder mellan 100 och 1000 baspar (beroende på vilka instrument som används). Det betyder att du måste bryta ner längre DNA-molekyler, klona och därefter sekvensera dem. Det finns två möjliga metoder.

Den första kallas kromosom (eller primer) walking och börjar med att sekvensera den första biten. Nästa (sammanhängande) del av sekvensen sekvenseras sedan med användning av en primer som är komplementär till slutet av den första avlästa sekvensen och så vidare. Denna teknik kräver inte mycket montering, men du behöver mycket primers och den är relativt långsam.

För att övervinna detta problem utvecklades hagelgevärssekvenseringsmetoden. Här bryts DNA:t i olika bitar (inte alla sönderdelade på samma plats), klonas och sekvenseras med primrar specifika för vektorn som används för kloning. Detta leder till överlappande sekvenser som sedan måste sättas ihop till en sekvens på datorn. Denna metod möjliggör parallellisering av sekvenseringen (du kan förbereda många sekvenseringsreaktioner samtidigt och köra dem) vilket gör processen mycket snabbare och även undviker behovet av sekvensspecifika primrar. Utmaningen är att organisera sekvenser i sin ordning, eftersom överlappningar inte är lika tydliga här. För att lösa detta problem görs ett första utkast och sedan sekvenseras kritiska regioner på nytt med andra tekniker såsom primerwalking.

Bearbeta

Den övergripande processen är som följer: En primer som matchar början av DNA:t till sekvensen används för att syntetisera en kort DNA-sträng intill den okända sekvensen, med början med primern (se PCR ). Den nya korta DNA-strängen sekvenseras med kedjetermineringsmetoden. Änden av den sekvenserade strängen används som en primer för nästa del av den långa DNA-sekvensen, därav termen "gå".

Metoden kan användas för att sekvensera hela kromosomer (därav "kromosomvandring"). Primer walking var också grunden för utvecklingen av shotgun-sekvensering , som använder slumpmässiga primers istället för specifikt utvalda.

Se även

• Kromosomhoppning
• Kromosomlandning
• Hagelgevärssekvensering – en alternativ metod som använder slumpmässiga, snarare än på varandra följande, delsträngar.