VÄLSIGNA
BLESS , även känd som breaks-märkning, anrikning på streptavidin och nästa generations sekvensering, är en metod som används för att upptäcka genomomfattande dubbelsträngad DNA-skada . I motsats till kromatinimmunoprecipitation (ChIP)-baserade metoder för att identifiera DNA-dubbelsträngsbrott (DSB) genom att märka DNA-reparationsproteiner, använder BLESS biotinylerade DNA-linkers för att direkt märka genomiskt DNA in situ vilket möjliggör högspecificitetsanrikning av prover på streptavidin pärlor och den efterföljande sekvenseringsbaserade DSB-mappningen till nukleotidupplösning.
Arbetsflöde
.png)
Biotinylerad länkdesign
Den biotinylerade länken är utformad för att bilda en hårnålsstruktur som specifikt märker DSB:er och inte enkelsträngade DNA-brott. Länken har en trubbig, ligerbar ände med en känd streckkodsekvens som märker ligeringsstället såväl som ett Xhol-restriktionsenzymigenkänningsställe intill streckkoden. Länkens hårnålsögla är kovalent bunden till en biotinmolekyl, vilket möjliggör efterföljande anrikning av märkt DNA med streptavidinkulor.
Användning av biotinmärkningar möjliggör specifik bindning utan avbrott i DNA på grund av den lilla storleken på markören. Eftersom biotin också har hög affinitet till streptavidin, kan ytterligare mycket specifik rening utföras på streptavidinkulor.
Kärnorrening och in situ -märkning
Efter induktion av DSB fixeras celler med formaldehyd, lyseras och behandlas med proteinaser för att rena intakta kärnor. Det initiala fixeringssteget stabiliserar kromatin och förhindrar bildandet av ytterligare DSB under provberedningen. DSB görs sedan trubbiga och inkuberas med biotinylerade länkar i närvaro av T4 DNA-ligas . T4-ligas känner inte igen enkelsträngade brott och märker som sådant direkt DSB-ställena genom kovalent fästning av den biotinylerade länken.
DNA-extraktion, fragmentering och rening
Märkt genomiskt DNA extraheras från kärnor och fragmenteras genom nedbrytning och sonikering med HaeIII-restriktionsenzym . Märkta DNA-fragment renas sedan med hjälp av pärlor härledda från streptavidin, ett biotinbindande protein som finns i bakterien Streptomyces avidinii . Eftersom interaktionen mellan streptavidin och biotin är stark och mycket specifik, möjliggör rening av provet på streptavidin-belagda pärlor robust anrikning av märkta DNA-fragment.
Distal linker DNA-märkning och digestion
Ett andra märkningssteg inträffar efter fragmentering och biotin-streptavidinaffinitetsrening för att fästa primerbindningsställen till den fria änden av det infångade DNA:t. I likhet med det första märkningssteget används T4 DNA-ligas för att fästa en distal linker till den omärkta änden av DNA:t. Den distala länken har också ett Xhol-restriktionsenzymigenkänningsställe men är inte kovalent bunden till en biotinmolekyl. När den distala länken väl är fäst, spjälkas de infångade DNA-fragmenten med användning av I-Scel-endonukleaser som skär både de biotinylerade länkarna och de distala länkarna för att frigöra DNA-fragmenten.
PCR-amplifiering och sekvensering
De digererade DNA-strängarna amplifieras med användning av PCR med primrar som är komplementära till streckkodssekvenser i den biotinylerade länken och den distala länken. Det amplifierade DNA:t bearbetas vidare genom digerering med Xhol-restriktionsenzymer för att avlägsna I-Scel-ändarna och renas före sekvensering. Även om användning av nästa generations sekvenseringsmetoder rekommenderas för BLESS-analys, har Sanger-sekvensering också visat sig generera framgångsrika, om än mindre robusta resultat.
Beräkningsanalys
BLESS-sekvensläsningarna kan analyseras med programvaran Instant Sequencing (iSeq). För att upptäcka ställen för DSB:er anpassas avläsningarna till ett referensgenom med hjälp av bowtie för att bestämma kromosompositionerna. Genomet är uppdelat i intervall och hypergeometriska tester används för att identifiera intervall berikade med kartlagda läsningar. DSB identifieras genom att jämföra anrikning i behandlade prover mot en kontroll. En statistiskt signifikant ökning av ett DNA-skada-inducerat prov tyder på att DNA:t vid detta intervall är skört och berikat med DSB.
Fördelar
- Användning av biotinylerade DNA-linkers utformade för att specifikt känna igen dubbelsträngade DNA-brott möjliggör en mindre partisk, mer direkt undersökning av breakomen utan att behöva förlita sig på nativa och/eller DSB-proxyproteiner, såsom den fosforylerade histonvarianten H2A.X (γH2A.X), i cellen. På grund av detta kan BLESS användas i en mängd olika celler från olika organismer.
- Av samma anledning är BLESS också känsligt för flera källor till dubbelsträngade avbrott, såsom kemiska och fysikaliska DNA-avbrott, replikationsgaffelstopp , såväl som närvaro av telomerändar . Detta gör BLESS lämplig för analys av celler vid olika förhållanden.
- Märkning av DSB sker in situ , vilket minskar risken för falska positiva vid upptäckt av DNA-brott på grund av mekanisk klippning och kemisk provbehandling.
Begränsningar
- På grund av specificiteten hos länkdesignen kan biotinylerade markörer endast märka dubbelsträngade DNA-brott vid trubbiga , inte kohesiva ändar, vilket leder till mindre effektiv ligering.
- Jämfört med nyare breakome-undersökningsmetoder, såsom BLISS, kräver BLESS stora mängder cellulärt utgångsmaterial för framgångsrik analys, vilket resulterar i tråkig och tidskrävande provberedning och bearbetning. För att bearbeta 24 prover kräver BLESS-protokollet 60 arbetstimmar under loppet av 15 dagar medan BLISS kräver 12 arbetstimmar under 5 dagar.
- Eftersom celler kräver kemisk fixering före DNA-extraktion, är BLESS benägen för högt bakgrundsljud från fixeringsartefakter. Men strikt anpassad optimering har visat sig minska detta problem.
- På grund av avsaknaden av PCR-kontroller är BLESS inte en helt kvantitativ metod och är benägen att förstärka bias, vilket resulterar i dålig skalbarhet.
- BLESS är endast lämplig för att detektera dubbelsträngade avbrott vid en specifik tidpunkt i genomet, jämfört med kontinuerlig analys.
Alternativa metoder
- Bryter märkning in situ och sekvensering (BLISS)
- I BLISS fästs celler eller vävnadssnitt på ett täckglas först innan DSB-märkning. Detta gör att vissa centrifugeringssteg kan utelämnas, vilket minskar antalet artificiella DSB som introduceras från provberedningen och minskar provförlusten. Viktigt är att det tillåter en mycket mindre mängd utgångsmaterial att användas jämfört med BLESS. En annan förbättring är användningen av in vitro -transkription för att generera och amplifiera RNA- sekvenser för biblioteksberedning . BLISS använder T7-bakteriofag -medierad transkription snarare än PCR, vilket minskar fel orsakade av PCR-amplifieringsbias som uppstår med BLESS.
- Immobilized-BLESS (i-BLESS)
- En begränsning av den ursprungliga BLESS-metoden är att den är problematisk vid applicering på mindre celler såsom jästceller . Medan låga centrifugeringshastigheter som används under kärnisolering inte är tillräckligt effektiva för små celler, kan ökande centrifugeringshastigheter klippa det genomiska DNA:t. Men i i-BLESS immobiliseras celler i agarospärlor före DSB-märkning. Detta tillåter användning av högre centrifugeringshastigheter utan artificiell DNA-skjuvning. Återstoden av DSB-märkningsproceduren följer den för BLESS-metoden, och märkta DNA-fragment återvinns från agarospärlorna före streptavidininfångningssteget. i-BLESS-metoden är inte begränsad till jäst och kan teoretiskt tillämpas på alla celler.
- DSBCapture
- I likhet med BLESS använder DSBCapture biotinylerade adaptrar för att märka DSBs in situ och streptavidinpärlor för att isolera märkta DNA-fragment för amplifiering och sekvensering. Medan märkning i BLESS förlitar sig på trubbig-ändligering, använder DSBCapture mer effektiv kohesiv-ändligering för att fästa biotinylerade modifierade Illumina-adaptrar . Dessutom är DSBCapture beroende av färre PCR-steg jämfört med BLESS, vilket minskar amplifieringsbias. Denna metod genererar också bibliotek med högre sekvensdiversitet än BLESS, vilket eliminerar behovet av att spika i andra bibliotek för att förbättra diversiteten före sekvensering. Dessutom använder DSBCapture single-end sekvensering i motsats till BLESS där sekvensering kan börja från båda ändar. Resultaten för sekvensering av en ände återspeglar endast sekvenserna av DSB-ställen, vilket förbättrar datautbytet.
- GUIDE-Seq
- Även känd som Genome-Wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing, GUIDE-Seq använder inkorporering av dubbelsträngade oligodeoxinukleotidsekvenser (dsODN) för att märka ställen för DSB:er i levande celler. Det gör att DSB:er kan märkas över en längre tidsperiod, och platserna för DNA-skador som identifierats genom GUIDE-Seq återspeglar ackumulerade DSB:er. Däremot märker och upptäcker BLESS endast övergående DSB som existerar när cellerna fixerades.
Ansökningar
Även om dubbelsträngade brott i DNA kan orsakas av olika källor till störningar, observeras de ofta med hög frekvens under apoptos och kan bidra till genominstabilitet, vilket resulterar i onkogena mutationer. Av denna anledning är högupplösta, specifika DSB-mappningsmetoder som BLESS användbara för breakome-undersökningar.
DSB kan induceras artificiellt med hjälp av genomredigeringsteknologier som CRISPR-Cas9 eller TALEN . Dessa teknologier kan leda till oavsiktliga modifieringar av DNA på platser utanför målet i genomet. Eftersom BLESS kan identifiera nukleotidpositionen för DSB, kan den användas för att avgöra om genomredigering utanför målet har inträffat och platsen för DSB:er som oavsiktligt introducerats av dessa nukleassystem.