Tvärbindande immunutfällning

Tvärbindning och immunfällning ( CLIP, eller CLIP-seq ) är en metod som används inom molekylärbiologin som kombinerar UV- tvärbindning med immunfällning för att identifiera RNA- bindningsställen för proteiner på en transkriptomomfattande skala, och därigenom öka vår förståelse av post-transkriptionell regulatoriska nätverk. CLIP kan användas antingen med antikroppar mot endogena proteiner, eller med vanliga peptidtaggar (inklusive FLAG, V5, HA och andra) eller affinitetsrening, vilket möjliggör möjligheten att profilera modellorganismer eller RBP som annars saknar lämpliga antikroppar.

Arbetsflöde

Grundprincipen för CLIP

CLIP börjar med in vivo tvärbindning av RNA-proteinkomplex med hjälp av ultraviolett ljus (UV). Vid UV-exponering bildas kovalenta bindningar mellan proteiner och nukleinsyror som är nära varandra (i storleksordningen Ångström från varandra). De tvärbundna cellerna lyseras sedan, RNA fragmenteras och proteinet av intresse isoleras via immunoutfällning. För att möjliggöra priming av omvänd transkription ligeras RNA-adaptrar till 3'-ändarna och RNA-fragment märks för att möjliggöra analys av RNA-proteinkomplexen efter att de har separerats från fritt RNA med hjälp av gelelektrofores och membranöverföring. Proteinas K- spjälkning utförs sedan för att avlägsna protein från det tvärbundna RNA:t, vilket lämnar några aminosyror vid tvärbindningsstället. Detta leder ofta till trunkering av cDNA vid den tvärbundna nukleotiden, vilket utnyttjas i varianter som iCLIP för att öka upplösningen av metoden. cDNA syntetiseras sedan via RT-PCR följt av sekvensering med hög genomströmning följt av kartläggning av läsningarna tillbaka till transkriptomet och andra beräkningsanalyser för att studera interaktionsställena.

Historik och applikationer

CLIP gjordes ursprungligen för att studera interaktioner mellan det neuronspecifika RNA-bindande proteinet och splitsningsfaktorerna NOVA1 och NOVA2 i mushjärnan , för att identifiera RNA-bindningsställen som innehöll de förväntade Nova-bindande motiven. Sekvensering av cDNA-biblioteket identifierade många positioner nära alternativa exoner, av vilka flera befanns kräva Nova1/2 för sina hjärnspecifika splitsningsmönster. Under 2008 kombinerades CLIP med sekvensering med hög genomströmning (kallad "HITS-CLIP") för att generera genomomfattande protein-RNA-interaktionskartor för Nova; sedan dess har ett antal andra RNA-bindande proteiner studerats med CLIP, inklusive PTBP1, RbFox2 (där det kallades "CLIP-seq"), SFRS1, Argonaute, hnRNP C, Fragile-X mental retardationsprotein FMRP, Ptbp2 (i mushjärnan), Mbnl2, nElavl-proteinerna (de neuronspecifika Hu-proteinerna), och har applicerats på RNA-bindande proteiner från livets alla riken, inklusive prokaryoter. CLIP-analys av det RNA-bindande proteinet Argonaute ledde till identifiering av mikroRNA-mål genom att avkoda mikroRNA -mRNA- och protein-RNA-interaktionskartor i mushjärnan och därefter i spirande jäst ( Saccharomyces cerevisiae ) , Caenorhabditis elegans , embryonala stamceller från cellkulturer och vävnadskulturceller. .

Metoder

HITS-CLIP

HITS-CLIP

HITS-CLIP kombinerar UV -tvärbindning och immunutfällning med sekvensering med hög genomströmning för att identifiera bindningsställen för RNA-bindande proteiner. HITS-CLIP introducerade också tillägget av dinukleotidstreckkoder till primers, vilket gav möjligheten att sekvensera och sedan dekonvolutera flera experiment samtidigt. Med analys av tvärbindningsinducerade mutationsställen (CIMS) vid höga sekvenseringsdjup , kan tvärbindningsställena differentieras från andra källor för sekvensvariation.

PAR-CLIP

PAR-CLIP

PAR-CLIP (fotoaktiverbar ribonukleosid-förstärkt tvärbindning och immunutfällning) används också för att identifiera bindningsställena för cellulära RNA-bindande proteiner (RBP) och mikroRNA-innehållande ribonukleoproteinkomplex (miRNPs). Metoden är beroende av inkorporering av fotoreaktiva ribonukleosidanaloger, såsom 4-tiouridin (4-SU) och 6-tioguanosin (6-SG) i begynnande RNA-transkript av levande celler. Bestrålning av cellerna med UV-ljus på 365 nm inducerar effektiv tvärbindning av fotoreaktiva nukleosid-märkta cellulära RNA till interagerande RBP. Immunoutfällning av RBP av intresse följs av isolering av det tvärbundna och samimmunoutfällda RNA:t. Det isolerade RNA:t omvandlas till ett cDNA-bibliotek och sekvenseras djupt med hjälp av sekvenseringsteknologi med hög genomströmning . Tvärbindning av 4-SU- och 6-SG-analogerna resulterar i tymidin till cytidin respektive guanosin till adenosin. Som ett resultat kan PAR-CLIP identifiera bindningsställena med hög noggrannhet.

Emellertid är PAR-CLIP begränsad huvudsakligen till odlade celler, och nukleosidcytotoxicitet är ett problem; det har rapporterats att 4-SU hämmar ribosomal RNA-syntes, inducerar ett nukleolärt stresssvar och minskar cellproliferation. PAR-CLIP har använts för att bestämma de transkriptomomfattande bindningsställena för flera kända RBP:er och mikroRNA-innehållande ribonukleoproteinkomplex vid hög upplösning. Detta inkluderar miRNA-inriktade AGO- och TNRC6-proteiner.

iCLIP

iCLIP

iCLIP (individual nucleotide-resolution crosslinking and immunoprecipitation) är en variant av CLIP som möjliggjorde amplifiering av trunkerade cDNA, som produceras när omvänd transkription stoppas i förtid vid tvärbindningsstället. Andra tillvägagångssätt för att identifiera protein-RNA-tvärbindningsställen inkluderar mutationsanalys av genomläsnings-cDNA, såsom nukleotidövergångar i PAR-CLIP , eller sällsynta fel som introduceras av omvänt transkriptas när det läser igenom tvärbindningsställena i standard HITS-CLIP- metoder, benämnda Crosslink analys av inducerade mutationsställen (CIMS).

iCLIP lade också till en slumpmässig sekvens (unik molekylär identifierare, UMI ) tillsammans med experimentella streckkoder till primern som används för omvänd transkription, och streckkodade därigenom unika cDNA för att minimera eventuella fel eller kvantitativa fördomar i PCR, och därmed förbättra kvantifieringen av bindningshändelser. Möjliggörande av amplifiering av trunkerade cDNA ledde till identifiering av platserna för RNA-proteininteraktioner i hög upplösning genom att analysera startpositionen för trunkerade cDNA, såväl som deras exakta kvantifiering med UMI:er med programvara som kallas "iCount " . Dessa innovationer av iCLIP antogs av senare varianter av CLIP som eCLIP och irCLIP. En annan modifiering av iCLIP, miCLIP, identifierar metylerade RNA-ställen med användning av mutant enzym eller modifieringsspecifik antikropp. Den kvantitativa karaktären hos iCLIP möjliggjorde jämförelse mellan prover på nivån av fullständiga RNA, eller för att studera kompetitiv bindning av flera RNA-bindande proteiner eller subtila förändringar i bindning av ett mutant protein vid nivån av bindningstoppar.

eCLIP



eCLIP (enhanced CrossLinking and ImmunoPrecipitation följt av high-throughput-sekvensering) används också för att kartlägga RBP-bindningsställen på RNA-transkriptomomfattande. eCLIP designades för att förbättra iCLIP genom att öka effektiviteten vid omvandling av renade RNA-fragment till cDNA-bibliotek. Vid publiceringen rapporterades eCLIP öka sådan effektivitet med >1000 gånger, vilket inte bara minskar bortkastad sekvensering av PCR-dubblettmolekyler, utan också dramatiskt minskar experimentella misslyckanden under CLIP-proceduren. Dessutom är amplifieringen i eCLIP nu jämförbar med RNA-seq, vilket möjliggör rigorös kvantitativ normalisering mot parade inputkontroller (för att ta bort bakgrund vid ribosomala och andra mycket rikliga RNA) såväl som kvantitativ jämförelse mellan toppar och prover, vilket möjliggör förmågan att detektera allel -specifik bindning eller differentiell RNA-bindning mellan tillstånd. Liksom i andra CLIP-metoder förlitar sig eCLIP på RBP-RNA-interaktioner kovalent kopplade med hjälp av UV-tvärbindning av levande celler. Celler lyseras sedan och RNA fragmenteras med användning av begränsad RNas-behandling. Ett specifikt RBP (och dess bundna RNA) immunoutfälls sedan med användning av en antikropp som specifikt känner igen det riktade RBP. Efter ligering av en 3' RNA-adapter körs immunutfällt material (liksom ett parat ingångsprov) på denaturerande proteingeler och överförs till nitrocellulosamembran. En region från proteinstorleken till 75 kDa ovan skärs från membranet och behandlas med Proteinas K för att frigöra RNA. Efter rensning omvänt transkriberas RNA till ssDNA, när en andra adapter ligeras. Genom att ligera den andra adaptern till cDNA kan eCLIP identifiera trunkerade cDNA, liknande iCLIP, och därigenom studera RNA-proteininteraktionsställen med hög upplösning. PCR-amplifiering används sedan för att erhålla tillräckligt med material för sekvensering med hög genomströmning. eCLIP kan också användas för att identifiera miRNA-mål och profilera RNA-modifieringar som m6A. eCLIP-datauppsättningar har producerats för över 150 RBP med validerade kommersiellt tillgängliga antikroppar.

Andra CLIP-metoder

sCLIP (enkel CLIP) är en teknik som kräver lägre mängder ingående RNA och utelämnar radiomärkning av det immunutfällda RNA:t. Metoden är baserad på linjär amplifiering av det immunutfällda RNA:t och förbättrar därigenom komplexiteten hos sekvenseringsbiblioteket trots att mängden inmatat material reduceras avsevärt och flera reningssteg utelämnas. Dessutom tillåter det en radiomärkningsfri visualisering av immunutfällt RNA genom att använda en mycket känslig biotinbaserad märkningsteknik. Tillsammans med en bioinformatisk plattform är denna metod utformad för att ge djupa insikter i RNA-proteininteraktomer inom biomedicinsk vetenskap, där mängden utgångsmaterial ofta är begränsad (dvs. när det gäller värdefulla kliniska prover).

Som en modifiering av CLIP identifierades metylerade RNA-ställen med användning av mutant enzym eller modifieringsspecifik antikropp med metoderna som kallas miCLIP eller m6A-CLIP.

Fördelar och begränsningar

Fördelar

RNA-bindande proteiner är ofta komponenter i multiproteinkomplex, och RNA från olika gener finns i celler i en mängd olika mängder, därför är det vanligt att RNA bundna till samrenade proteiner eller icke-specifikt fastnar på pärlor kan isoleras vid immunutfällning av ett specifikt protein. Dataspecificiteten som erhålls med tidiga immunoutfällningsmetoder som RIP har visat sig vara beroende av reaktionsbetingelserna för experimentet, såsom proteinkoncentrationer och joniska förhållanden, och återassociering av RNA-bindande proteiner efter cellys kan leda till detektion av artificiella interaktioner . Formaldehydtvärbindningsmetoder har använts för att bevara RNA-proteininteraktioner, men dessa genererar också protein-proteintvärbindningar. Genom att använda UV-tvärbindning som är specifik för direkta protein-RNA-kontakter, undviker CLIP protein-protein-tvärbindningar och säkerställer hög specificitet, samtidigt som man får positionsinformation om platserna för protein-RNA-interaktioner.

Eftersom UV-tvärbindning skapar en kovalent bindning, behåller de tvärbundna RNA-fragmenten en kort peptid efter Proteinas K-digestion, som kan utnyttjas för att identifiera tvärbindningsstället. Omvänd transkription trunkeras oftast vid tvärbindningsställena, vilket skapar trunkerade cDNA som utnyttjas av iCLIP, medan genomläsningscDNA ofta innehåller mutationer på tvärbindningsstället (se HITS-CLIP och PAR-CLIP).

Begränsningar

KLIPP Sammanfattning

Alla protokoll för generering av CLIP-bibliotek kräver måttliga mängder celler eller vävnad (50–100 mg), kräver många enzymatiska steg och anpassade beräkningsanalyser. Vissa steg är svåra att optimera och har ofta låg effektivitet. Till exempel kan översmältning med RNase minska antalet identifierade bindningsställen och behöver därför optimeras. Tvärbindningseffektiviteten varierar också mellan proteiner, och nukleotidbias för tvärbindning har rapporterats, till exempel genom att jämföra tvärbindningsställen och motiv berikade när protein-RNA-komplex studeras in vivo i levande celler och in vitro, även om metoder utvecklas för att minimera sådan partiskhet för berikad motivupptäckt. Beräkningsmässigt förutsagda miRNA-mål härledda från TargetScan är jämförbara med CLIP för att identifiera miRNA-mål, vilket väcker frågor om dess användbarhet i förhållande till befintliga förutsägelser. Eftersom CLIP-metoder är beroende av immunutfällning, kan tvärbundet RNA i vissa fall påverka antikropp-epitopinteraktioner. Slutligen har betydande skillnader observerats. Därför kräver råa CLIP-resultat ytterligare beräkningsanalyser för att noggrant undersöka RNA-proteinbindningsställets interaktioner inom cellen.

Liknande metoder

  • RIP-Chip studerar anrikning av fullständiga RNA efter immunutfällning av specifikt protein följt av mikroarrayanalys, men utan att använda tvärbindning identifierar det inte RNA-bindningsställen
  • ChIP-Seq , metod för att hitta interaktioner med DNA snarare än RNA
  • SELEX , en n vitro -metod för att hitta en konsensusbindningssekvens

Vidare läsning

  • starBase-databas : en databas för att utforska miRNA-lncRNA, miRNA-mRNA, miRNA-sncRNA, miRNA-circRNA, protein-lncRNA, protein-RNA-interaktioner och ceRNA- nätverk från PAR -CLIP ( CLIP-Seq , HITS-CLIP , iCLIP , CLASH ) data och TargetScan , PicTar, RNA22, miRanda och PITA mikroRNA-målplatser.
  • BIMSB doRiNA-databas : en databas för att utforska protein-RNA- och mikroRNA- målinteraktioner från CLIP-Seq , HITS-CLIP , PAR-CLIP , iCLIP -data och PICTAR-mikroRNA-målplatsförutsägelser.
  • miRTarCLIP : En beräkningsmetod för identifiering av mikroRNA-målinteraktioner med hjälp av CLIP- och PAR-CLIP- sekvensering med hög genomströmning .
  • clipz : en pipeline för att analysera korta RNA-avläsningar från HITS-CLIP-experiment.
  • dCLIP : dCLIP är ett Perl-program för att upptäcka differentiella bindningsregioner i två jämförande CLIP-Seq (HITS-CLIP, PAR-CLIP eller iCLIP) experiment.

Källor

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cross-linking_immunoprecipitation&oldid=1140860343 "