Transplastomisk växt
En transplastomisk växt är en genetiskt modifierad växt där gener inaktiveras, modifieras eller nya främmande gener sätts in i plastiders DNA som kloroplasten istället för nukleärt DNA .
För närvarande är majoriteten av transplastomiska växter ett resultat av kloroplastmanipulation på grund av dåligt uttryck i andra plastider . Tekniken har dock framgångsrikt tillämpats på kromoplaster av tomater .
Kloroplaster i växter tros ha sitt ursprung från en uppslukande händelse av en fotosyntetisk bakterie ( cyanobakteriell förfader ) av en eukaryot. Det finns många fördelar med kloroplast-DNA-manipulation på grund av dess bakteriella ursprung. Till exempel förmågan att introducera flera gener (operoner) i ett enda steg istället för många steg och samtidigt uttryck av många gener med dess bakteriella genuttryckssystem. Andra fördelar inkluderar möjligheten att få fram ekologiska produkter som proteiner i en hög koncentration och det faktum att produktionen av dessa produkter inte kommer att påverkas av epigenetisk reglering .
Anledningen till produktsyntes vid höga koncentrationer är att en enda växtcell potentiellt kan bära upp till 100 kloroplaster. Om alla dessa plastider transformeras kan alla uttrycka de införda främmande generna. Detta kan vara fördelaktigt jämfört med transformation av kärnan, eftersom kärnan vanligtvis bara innehåller en eller två kopior av genen .
Fördelarna med kloroplast-DNA-manipulation har sett ett växande intresse för detta område av forskning och utveckling, särskilt inom jordbruks- och farmaceutiska tillämpningar. Det finns dock vissa begränsningar i kloroplast-DNA-manipulation, såsom oförmågan att manipulera från spannmålsgrödor och dåligt uttryck av främmande DNA i icke-gröna plastider som nämnts tidigare. Dessutom kan avsaknaden av posttranslationsmodifieringsförmåga som glykosylering i plastider göra visst humanrelaterat proteinuttryck svårt. Ändå har stora framsteg gjorts när det gäller växttransplastomik, till exempel produktion av ätbara vacciner mot stelkramp genom att använda en transplastomisk tobaksplanta .
Omvandlings- och urvalsförfarande
Genkonstruktion
Det första kravet för generering av transplastomisk växt är att ha en lämplig genkonstruktion som kan introduceras i en plastid som en kloroplast i form av en E. coli- plasmidvektor . Det finns flera nyckelegenskaper hos en lämplig genkassett inklusive men inte begränsat till ( 1 ) selekterbar markör ( 2 ) flankerande sekvenser ( 3 ) gen av intresse ( 4 ) promotorsekvenser ( 5 ) 5' UTR ( 6 ) 3' UTR ( 7) ) intercistroniska element . Den selekterbara markören tenderar vanligtvis att vara en antibiotikaresistent gen, vilket skulle ge växtcellen förmågan att tolerera att odlas på agarplattor som innehåller antibiotika. Flankerande sekvenser är avgörande för introduktion av genkonstruktionen vid exakta förutbestämda punkter i plastidgenomet genom homolog rekombination . Genen av intressen som introduceras har många olika tillämpningar och kan sträcka sig från skadedjursresistensgener till vaccinantigenproduktion. Intercistroniska element (IEE) är viktiga för att underlätta höga nivåer av genuttryck om flera gener introduceras i form av en operon . Slutligen förbättrar 5' UTR och 3' UTR ribosomal bindning respektive ökar transkriptstabiliteten.
Förvandling och urval
Den vanligaste metoden för plastidtransformationer är biolistik : Små guld- eller volframpartiklar beläggs med plasmidvektorn och skjuts in i unga växtceller eller växtembryon, penetrerar flera cellskikt och in i plastiden. Det kommer då att ske en homolog rekombinationshändelse mellan shotplasmidvektorn och plastidens genom , vilket förhoppningsvis resulterar i en stabil insättning av genkassetten i plastiden. Även om transformationseffektiviteten är lägre än vid agrobakteriell förmedlad transformation, vilket också är vanligt inom växtgenteknik, är partikelbombardement särskilt lämpligt för kloroplasttransformation. Andra transformationsmetoder inkluderar användningen av polyetylenglykol (PEG)-medierad transformation, vilket innebär att växtcellväggen avlägsnas för att exponera den "nakna" växtcellen för det främmande genetiska materialet för transformation i närvaro av PEG. PEG-medierad transformation är dock notoriskt tidskrävande, mycket teknisk och arbetsintensiv eftersom den kräver borttagning av cellväggen som är en viktig skyddande strukturell komponent i växtcellen. Intressant nog har ett dokument som släpptes 2018 beskrivit en framgångsrik plastidomvandling av kloroplasten från mikroalgerterna N. oceanica och C. reinhardtii genom elektroporering . Även om ingen studie ännu har gjorts för plastidomvandling av högre växter med hjälp av elektroporering, kan detta vara ett intressant område för studier för framtiden.
För att bestå och bibehållas stabilt i cellen måste en plasmid-DNA-molekyl innehålla ett replikationsursprung , vilket gör att den kan replikeras i cellen oberoende av kromosomen . När främmande DNA först introduceras till växtvävnaden kommer inte alla kloroplaster att framgångsrikt ha integrerat det införda genetiska materialet. Det kommer att finnas en blandning av normal och transformerad kloroplast i växtcellerna. Denna blandning av normala och transformerade kloroplaster definieras som " heteroplasmatisk " kloroplastpopulation. Stabilt genuttryck av den introducerade genen kräver en " homoplasmatisk " population av transformerade kloroplaster i växtcellerna, där alla kloroplaster i växtcellen framgångsrikt har integrerat det främmande genetiska materialet. Typiskt kan homoplasmicitet uppnås och identifieras genom flera omgångar av urval av antibiotika. Det är här den transformerade växtvävnaden odlas upprepade gånger på agarplattor som innehåller antibiotika som spectinomycin. Endast växtceller som framgångsrikt har integrerat genkassetten som visas ovan kommer att kunna uttrycka den antibiotikaresistens valbara markören och växer därför normalt på agarplattor som innehåller antibiotika. Växtvävnad som inte växer normalt kommer att ha ett blekt utseende eftersom spektinomycinantibiotikumet hämmar ribosomerna i växtcellens plastider och förhindrar därigenom underhåll av kloroplasten. Men eftersom heteroplasmisk population av kloroplaster fortfarande kan växa på agarplattor effektivt , krävs många omgångar av antibiotikaselektion och återväxt för att odla en växtvävnad som är homoplasmisk och stabil. Generering av homoplasmatisk växtvävnad anses vara en stor svårighet inom transplastomik och otroligt tidskrävande.
Ympning
Vissa växtarter som Nicotiana tabacum är mer mottagliga för transplastomics jämfört med medlemmar av samma släkte som Nicotiana glauca och Nicotiana benthamiana . Ett experiment som genomfördes 2012 visade på möjligheten att underlätta transplastomik för svåra växtarter med ympning . Ympning sker när två olika växter sammanfogas och fortsätter att växa, denna teknik har använts i stor utsträckning i jordbruksapplikationer och kan till och med förekomma naturligt i naturen. En transplastomisk N. tabacum -växt konstruerades för att ha spektinomycinresistens och GFP-fluorescens . Medan de nukleära transgena växterna N. benthamiana och N. glauca konstruerades för att ha kanamycinantibiotikaresistens och YFP-fluorescens . Den transplastomiska växten och de nukleära transgena växterna ympades sedan på varandra och de ympade vävnaderna analyserades sedan. Fluorescensmikroskopi och antibiotikaselektion på agarplattor med både kanamycin och spektinomycin avslöjade att den ympade växtvävnaden hade både transplastomik och nukleärt transgent DNA-material. Detta bekräftades ytterligare genom PCR- analys. Denna studie visade att plastider som kloroplasten kan passera mellan celler över transplantatövergångar och resultera i överföring av genetiskt material mellan två olika växtcellinjer. Detta fynd är betydelsefullt eftersom det ger en alternativ väg för generering av transplastomiska växter för arter som inte är lika lätta att omvandla med vår nuvarande experimentella metodik som ses ovan.
Optimering av transgenuttryck
Inducerbara uttryckssystem såsom teoriboswitchar och repeterande pentatrikopeptidproteiner har studerats brett i ett försök att kontrollera och modulera uttryck av transgena produkter i transplastomiska växter. En stor fördel med att använda inducerbara uttryckssystem är att optimera koncentrationen av transgenproteinproduktion. Till exempel behöver unga växter ägna energi och resurser till tillväxt och utveckling för att bli mogna växter. Konstitutivt uttryck av transgenen skulle därför vara skadligt för växternas tillväxt och utveckling, eftersom det tar bort värdefull energi och resurser att uttrycka den främmande genkonstruktionen istället. Detta skulle resultera i en dåligt utvecklad transplastomisk anläggning med lågt produktutbyte. Inducerbart uttryck av transgenen skulle övervinna denna begränsning och tillåta växten att mogna helt som en normal vildtypsväxt innan den induceras kemiskt för att påbörja produktion av transgenen som sedan kan skördas.
Biologisk inneslutning och jordbrukssamlevnad
_in_a_field_in_Intercourse,_Pennsylvania..jpg)
Genmodifierade växter måste vara säkra för miljön och lämpliga för samexistens med konventionella och ekologiska grödor . Ett stort hinder för traditionella nukleära genetiskt modifierade grödor utgörs av den potentiella överkorsningen av transgenen via pollenrörelse. Till en början trodde man att plastidomvandling, som ger transplastomiska växter där pollenet inte innehåller transgenen, inte bara ökar biosäkerheten utan också underlättar samexistensen av genetiskt modifierat, konventionellt och ekologiskt jordbruk. Att utveckla sådana grödor var därför ett viktigt mål för forskningsprojekt som Co-Extra och Transcontainer.
En studie utförd på tobaksplantan 2007 har dock motbevisat denna teori. Under ledning av Ralph Bock från Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology i Tyskland studerade forskare genetiskt modifierad tobak där transgenen var integrerad i kloroplaster. En transplastomisk tobaksväxt genererad genom kloroplastmedierad transformation föds upp med växter som var hansterila med en orörd kloroplast. De transplastomiska växterna konstruerades för att ha resistens mot antibiotikumet spectinomycin och konstruerades för att producera en grön fluorescerande proteinmolekyl ( GFP). Därför antogs en hypotes att alla avkommor som produceras av dessa två linjer av tobaksplantor inte skulle kunna växa på spektinomycin eller vara fluorescerande, eftersom det genetiska materialet i kloroplasten inte borde kunna överföras via pollen. Det visade sig dock att en del av fröna var resistenta mot antibiotikan och kunde gro på spektinomycinagarplattor. Beräkningar visade att 1 av varje miljon pollenkorn innehöll plastidgenetiskt material, vilket skulle vara betydande i en jordbruksmiljö. Eftersom tobak har en stark tendens till självbefruktning, antas tillförlitligheten hos transplastomiska växter vara ännu högre under fältförhållanden. Därför tror forskarna att endast en av 100 000 000 GM-tobaksplantor faktiskt skulle överföra transgenen via pollen. Sådana värderingar är mer än tillfredsställande för att säkerställa samexistens. Men för genetiskt modifierade grödor som används vid produktion av läkemedel, eller i andra fall där absolut ingen utkorsning är tillåten, rekommenderar forskarna kombinationen av kloroplastomvandling med andra biologiska inneslutningsmetoder , såsom cytoplasmatisk manlig sterilitet eller transgenreducerande strategier. Denna studie visade att även om transplastomiska växter inte har absolut geninneslutning är nivån av inneslutning extremt hög och skulle möjliggöra samexistens av konventionella och genetiskt modifierade jordbruksgrödor.
Det finns allmänhetens oro angående en möjlig överföring av antibiotikaresistenta gener till oönskade mål, inklusive bakterier och ogräs. Som ett resultat av detta har teknologier utvecklats för att ta bort den valbara antibiotikaresistensgenmarkören. En sådan teknologi som har implementerats är Cre/lox-systemet , där det nukleärt kodade Cre-rekombinaset kan placeras under kontroll av en inducerbar promotor för att avlägsna den antibiotikaresistenta genen när homoplasmicitet har uppnåtts från transformationsprocessen.
Exempel och framtiden
Ett färskt exempel på transplastomik i jordbrukstillämpningar var att ge potatisväxter skydd mot Colorado-potatisbaggen . Denna skalbagge kallas internationellt för en "superpest" eftersom den har fått motstånd mot många insekticider och är extremt glupska matare. Skalbaggen beräknas orsaka upp till 1,4 miljoner USD i skördeskador årligen bara i Michigan. En studie utförd 2015 av Zhang använde transplastomik för att introducera dubbelsträngat RNA- producerande transgener i plastidgenomet. Det dubbelsträngade RNA:t ger skydd till den transgena potatisplantan via en RNA-interferensmetodik , där konsumtion av växtvävnaden av potatisbaggen skulle resultera i tystnad av nyckelgener som krävs av skalbaggen för att överleva. Det gavs en hög skyddsnivå, bladen från den transplastomiska potatisplantan var för det mesta oanvända när de exponerades för de vuxna skalbaggarna och larverna. Undersökningen avslöjade också en dödande effekt på 83 % för larver som konsumerade bladen från den transplastomiska växten. Denna studie belyser att när skadedjur blir motståndskraftiga mot traditionella kemiska insekticider, kan användningen av transplastomik för att leverera RNAI-medierade växtskyddsstrategier bli allt mer lönsam i framtiden.
Ett annat anmärkningsvärt transplastomiskt tillvägagångssätt är produktionen av artemisinsyra genom transplastomiska tobaksväxter som är prekursormolekylen som kan användas för att producera artemisinin . Artemisininbaserad kombinationsterapi är den föredragna och rekommenderade behandlingen av WHO (World Health Organization) mot malaria . Artemisinin kommer naturligt från växten Artemisia annua , dock kan endast låga koncentrationer av artemisinin i växten skördas naturligt och det finns för närvarande ett otillräckligt utbud för den globala efterfrågan. En studie som genomfördes 2016 ledd av Fuentes, lyckades introducera produktionsvägen för artemisininsyra i kloroplasten av N. tabacum genom ett biolistiskt tillvägagångssätt innan de använde deras nya syntetiska biologiverktyg COSTREL ( kombinatoriell s upptransformation av t ransplastomiska r ecipientl ines ) generera en transplastomisk N. tabacum -växt som hade ett mycket högt utbyte av arteminisinsyra. Denna studie illustrerar de potentiella fördelarna med transplastomics för biofarmaceutiska tillämpningar i framtiden.
Trots att transplastomik inte är livskraftig för icke-gröna plastider för tillfället, har växttransplastomikarbete på kloroplastgenomet visat sig vara extremt värdefullt. Ansökningarna för kloroplastomvandling inkluderar och är inte begränsade till jordbruk, biobränsle och bioläkemedel. Detta beror på ett fåtal faktorer, som inkluderar enkelhet av multipla transgenuttryck i form av operoner och uttryck med högt antal kopior. Studiet av transplastomik är fortfarande ett pågående arbete. Mer forskning och utveckling krävs fortfarande för att förbättra andra områden som transplastomik i icke-gröna plastider, oförmåga att omvandla spannmålsgrödor genom transplastomik och ett sätt att kringgå bristen på glykosyleringsförmåga i kloroplasten. Ytterligare förbättringar inom detta studieområde kommer bara att ge oss en potentiell robust bioteknisk väg i många tillämpningar som är viktiga i vårt dagliga liv.
externa länkar
- Co-Extra Forskning om samexistens och spårbarhet av genetiskt modifierade växter
- Transcontainer Utveckla biologiska inneslutningssystem för genetiskt modifierade växter