Syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformextraktion

Syra guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformextraktion (förkortat AGPC ) är en vätske-vätskeextraktionsteknik inom biokemi . Det används ofta inom molekylärbiologi för att isolera RNA (liksom DNA och protein i vissa fall). Denna metod kan ta längre tid än ett kolonnbaserat system som den kiseldioxidbaserade reningen, men har högre renhet och fördelen med hög utvinning av RNA: [ ^{citat behövs nukleotider} ] en RNA-kolonn är vanligtvis olämplig för rening av korta (<200 ) ) RNA-arter, såsom siRNA , miRNA , gRNA och tRNA .

Det skapades ursprungligen av Piotr Chomczynski och Nicoletta Sacchi , som publicerade sitt protokoll 1987. Reagenset säljs av Sigma-Aldrich under namnet TRI Reagent; av Invitrogen under namnet TRIzol ; av Bioline som Trisure; och genom Tel-Test som STAT-60.

Hur det fungerar

Denna metod bygger på fasseparation genom centrifugering av en blandning av vattenprovet och en lösning innehållande vattenmättad fenol och kloroform , vilket resulterar i en övre vattenfas och en lägre organisk fas (huvudsakligen fenol). Guanidiniumtiocyanat , ett kaotropiskt medel , tillsätts till den organiska fasen för att hjälpa till med denatureringen av proteiner (som de som starkt binder nukleinsyror eller de som bryter ned RNA). Nukleinsyrorna (RNA och/eller DNA) fördelar sig i vattenfasen, medan protein uppdelas i den organiska fasen. Blandningens pH avgör vilka nukleinsyror som renas. Under sura förhållanden (pH 4-6) fördelas DNA i den organiska fasen medan RNA förblir i vattenfasen. Under neutrala förhållanden (pH 7-8) fördelas både DNA och RNA i vattenfasen. I ett sista steg utvinns nukleinsyrorna från vattenfasen genom utfällning med 2-propanol . 2-propanolen tvättas sedan med etanol och pelleten lufttorkas kort och löses i TE-buffert eller RNAse-fritt vatten.

Guanidiniumtiocyanat denaturerar proteiner, inklusive RNaser, och separerar rRNA från ribosomala proteiner, medan fenol , isopropanol och vatten är lösningsmedel med dålig löslighet. I närvaro av kloroform eller BCP (bromklorpropan) separeras dessa lösningsmedel helt i två faser som känns igen på sin färg: en klar, övre vattenfas (innehållande nukleinsyrorna) och en nedre fas (innehållande proteinerna lösta i fenol och lipider lösta i kloroform). Andra denaturerande kemikalier såsom 2-merkaptoetanol och sarkosin kan också användas. Den stora nackdelen är att fenol och kloroform är både farliga och obekväma material, och utvinningen är ofta mödosam, så på senare år erbjuder många företag nu alternativa sätt att isolera RNA.

Reagens

Fenol : Fenolen som används för biokemi kommer som en vattenmättad lösning med Tris-buffert , som en Tris-buffrad 50 % fenol, 50 % kloroformlösning, eller som en Tris-buffrad 50 % fenol, 48 % kloroform, 2 % isoamylalkohol lösning (kallas ibland "25:24:1"). Fenol är naturligt något vattenlösligt och ger ett luddigt gränssnitt, som skärps av närvaron av kloroform, och isoamylalkoholen minskar skumbildning. De flesta lösningar har också en antioxidant, eftersom oxiderad fenol skadar nukleinsyrorna. För RNA-rening hålls pH-värdet runt 4, vilket behåller RNA i vattenfasen företrädesvis. För DNA-rening är pH vanligtvis nära 7, då alla nukleinsyror finns i vattenfasen.
Kloroform : Kloroform stabiliseras med små mängder amylen eller etanol , eftersom exponering av ren kloroform för syre och ultraviolett ljus producerar fosgengas . Vissa kloroformlösningar kommer som färdiggjorda en blandning av 96 % kloroform, 4 % isoamylalkohol som kan blandas med en lika stor volym fenol för att erhålla lösningen 25:24:1.
Isoamylalkohol : Isoamylalkohol kan minska skumbildning och säkerställa deaktivering av RNaser.

Se även

externa länkar