Startpunkt (jäst)
Startkontrollpunkten är en viktig cellcykelkontrollpunkt i jäst . Startkontrollpunkten säkerställer irreversibel cellcykelinträde även om förhållandena senare blir ogynnsamma. De fysiologiska faktorerna som styr passagen genom startkontrollpunkten inkluderar externa näringskoncentrationer, närvaro av parningsfaktor/feromon, former av stress och storlekskontroll.
Tidig karaktärisering av Start
I ett försök att studera de ordnade händelserna i cellcykeln, Leland Hartwell et al. screenade för och karakteriserade temperaturkänsliga mutanter, även kända som celldelningscykelmutanter (cdc-mutanter), som uppvisar stoppad cellulär utveckling i olika stadier av cykeln. Hartwell identifierade inte bara mutanten, cdc28, som stannar i mycket tidiga skeden av cellcykeln, utan han insåg också att närvaron av parningsfaktorer kunde resultera i liknande fenotyper av hämmad knoppbildning och avsaknad av DNA-syntes. Noterbart, celler som exponerades för parningsfaktorer i senare skeden av cykeln fortsatte divisionen och stoppades först när de resulterande dottercellerna nådde de "tidiga stadierna" (eller mer tekniskt, G1-fasen) av cellcykeln. Dessa resultat tyder på att både cdc28 och parningsferomoner förmedlar sådana tidiga händelser, och antyder vidare att det finns en punkt i cellcykeln där cellen förbinder sig till delning snarare än till parning. Hartwell kallade denna punkt "Start", där celler är känsliga för parningsferomoner innan de når detta stadium, men okänsliga för parningsfaktorer efteråt.
Under åren efter Hartwells arbetsintensiva experiment har det visat sig att andra miljöfaktorer bidrar till cellulärt öde i jäst och analogt i andra organismer. Även om den inte är jästspecifik, har en kritisk studie som lagts fram av Zetterberg et al . 1985 gav bevis för en åtagandepunkt i schweiziska 3T3-celler, eller musembryonfibroblaster, när de odlades under serumrika eller serumsvältade förhållanden. Liksom svaret på parningsferomoner i Hartwells experiment var svaret på serumsvält inte enhetligt bland alla celler. Endast postmitotiska celler yngre än tre timmar stoppade celldelningen under dessa förhållanden, medan celler äldre än fyra timmar var okänsliga för frånvaron av tillväxtfaktorer. Dessa experimentella resultat visar starka bevis för en åtagandepunkt för att gå in i mitos , och antyder följaktligen att cellen är kapabel att känna av sin miljö för ledtrådar som tillväxtfaktorer innan den begår.
Transkription av G1/S-gener
Transkriptionen av flera G1/S-gener är avgörande för att celler ska kunna fortsätta genom cellcykeln. I spirande jäst aktiveras transkriptionen av över 200 gener vid G1/S-övergången. Transkriptionen av dessa G1/S-gener regleras primärt av två genreglerande proteiner, SBF och MBF. Dessa regulatoriska proteiner bildar komplex med SCB respektive MCB, som är belägna på promotorerna för G1/S-gener.
SBF och MBF regulatoriska proteiner
SBF- och MBF-komplexen kan aktivera G1/S-transkription endast om ett inhibitorprotein känt som Whi5 dissocieras. Dissociationen av Whi5 kräver fosforylering av ett Cln3- Cdk1 -komplex. Detta indikerar att aktiviteten av Cln3-Cdk1 spelar en viktig roll i startkontrollpunkten på grund av dess nödvändighet att samtidigt aktivera både SBF- och MBF-proteiner. Aktiviteten av Cln3 korrelerar med celltillväxthastighet.
Aktivering av S-Cdks av G1/S-Cdks
G1/S-gener inkluderar cyklinerna Cln1 och Cln2, som kan bilda aktiva komplex med Cdk1. Dessa aktiverade Cln-Cdk-komplex hjälper till att aktivera S-Cdk-komplex, som normalt hämmas av Sic1. Sic1 har ingen effekt på Cln-Cdk-komplexen. Cln-Cdk-komplexen aktiverar S-Cdk-komplexen genom att förstöra Sic1 genom fosforylering och efterföljande SCF ubiquitination .
Parningsfaktor/ feromon
Proteininteraktioner mellan parningsväg och cellcykelprogression
Svaret på parningsferomoner som beskrivs i Hartwells experiment är föga överraskande med tanke på de antagonistiska biokemiska interaktionerna mellan parningsvägen och G1-cyklinerna som främjar cellcykelprogression.
Som visas i den medföljande figuren består parningsvägen av en MAPK (mitogenaktiverat proteinkinas)-kaskad, där Ste5 förmedlar feromonsignalen och kinassvaren nedströms av Ste11, Ste7 och Fus3. Från dess nedströmseffekter och även omedelbara sådana, aktiverar Fus3 slutligen Far1, som direkt hämmar aktiviteten hos G1-cyklinerna, Cln1/2.
I sin tur hämmar Cln1/2 direkt parningsvägen via Far1- och Ste5-hämning. Aktiviteten av Cln1/2 medieras genom aktivering av ett mer uppströms Gl-cyklin, Cln3. Cln3, tillsammans med det cyklinberoende kinaset Cdc28, inaktiverar och främjar exporten av den nukleära Whi5. Exporten av Whi5 resulterar i partiell aktivering av transkriptionsfaktorerna SBF och MBF, vilket i slutändan främjar cellcykelprogression. Dessa transkriptionsfaktorer främjar Cln1/2-uttryck och förbättrar cellcykelsvaret genom att bilda en positiv återkopplingsslinga, eftersom Cln1/2 främjar SBF-aktivering och Whi5-export.
Kvantitativ beskrivning av start
En modern studie som beskriver förhållandet mellan parningsstopp och cellcykelprogression lades fram av Doncic et al. i juni 2011. Författarna insåg att mängden nukleär Whi5 är en indikator på G1-cyklinaktivitet, och författarna försökte kvantitativt förstå punkten vid vilken celler förbinder sig till delning. Med en mikrofluidisk plattform exponerades en asynkron population av celler för feromonen, alfa-faktor. Med hjälp av ett Whi5-GFP-fusionsprotein spårade de mängden nukleär Whi5 efter tillägg av alfa-faktor och noterade om cellen stoppade eller fortsatte delningen. Som väntat stoppade pre-Start-celler celldelningen efter feromontillsats, vilket indikeras av den lilla delen av Whi5-exporten. Omvänt var celler efter start okänsliga för alfa-faktor och fortsatt delning, vilket återspeglas av den stora delen av Whi5-exporten. Således återspeglas det differentiella svaret på närvaron av feromoner i om cellen är före eller efter start, tillstånd som kan karakteriseras av hur mycket Whi5 som finns i kärnan. Logistisk regression användes sedan för att beräkna sannolikheten för arrestering i förhållande till andelen exporterad Whi5 och visade en skarp växling mellan arrestering och progression när cirka 50% av Whi5 exporterades från kärnan. Det visades också att denna del av exporterad Whi5 motsvarar aktiveringen av den positiva återkopplingsslingan Cln1/2 (se nedan). Sammanfattningsvis indikerar detta att Start definieras av aktiveringen av Cln1/2-återkopplingsslingan.
Roll av Whi5 i cellcykelprogression
Som nämnts ovan är G1-cyklinerna, Cln1/2, en del av en positiv återkopplingsslinga som främjar deras egen transkription och aktiveringen av SBF- och MBF-transkriptionsfaktorer. År 2008 har Skotheim et al. föreslog att denna återkopplingsslinga möjliggör en stark signal att begå celldelning av de SBF- och MBF-reglerade generna. De antog att utan ett sammanhängande uttryck av generna som är nödvändiga för tidiga händelser, som DNA-replikation och knoppplatsbildning, skapar slumpmässiga individuella cellulära signaler brus som försvagar engagemangssvaret. Notera de långa och asynkrona induktionstiderna för CLN2 och RAD27 (en gen i SBF/MBF-regulonet) i cln1∆cln2∆-celler jämfört med vildtyp, Skotheim et al. drog således slutsatsen att den positiva återkopplingsmekanismen Cln1/2 möjliggör ett synkront och mer effektivt uttryck av SBF/MBF-regulonet.
Författarna observerade vidare att Whi5-fosforylering och åtföljande inaktivering spelar en roll i detta positiva återkopplingssvar. En Whi5-allel som saknar sex av tolv fosforyleringsställen resulterar i en långsam utgång från kärnan, och följaktligen en mindre koherent induktion av CLN2- och RAD27-uttryck. Sålunda stör oförmågan att fosforylera Whi5 den positiva återkopplingsslingan för Cln1/2 och minskar i sin tur det koherenta regulonuttrycket.
Molekylär dynamik mellan parningsväg och cellcykelprogression
För att ytterligare belysa en biokemisk förklaring mellan parningsstopp och cellcykelåtagande, Doncic et al. genomförde samma engagemangsanalys som beskrivits ovan på olika mutantstammar. Mutanten, FAR1-S87A, saknar CDK-fosforyleringsställen, och därför äventyras Cln1/2-hämning av Far1. Resultatet är en ökning av mängden Whi5-export som krävs för att engagera sig i celldelning, vilket tyder på att Far 1-fosforylering är nyckeln till cellulärt engagemang. Omvänt ändrar inte mutanten, STE5-8A, som saknar CDK-fosforyleringsställen (och därmed Cln1/2-hämning av Ste5), inte åtagandepunkten, vilket tyder på att sådan hämning av parningsvägen inte är kritisk för Start. En ytterligare time-lapse-analys av STE5-8A-celler avslöjar att dessa mutanta celler inte helt kan förbinda sig till celldelning, eftersom celler som exponeras för alfa-faktor kommer att knoppas och sedan återgå till parning utan att fullborda cellcykeln. Doncic et al. föreslog att den ofullständiga uppdelningen berodde på uttryck av gener i både parningsvägen och i den G1-cyklindrivna cellulära progressionen. Spårning av uttrycket av FUS1pr-GFP, en gen för parningsvägen, och av CLN2pr-mCherry, en cellcykelgen, visade faktiskt stort samuttryck i STE5-8A-celler i förhållande till vildtypsceller.
Således tillåter Cln1/2-hämning av Far1 inträde i cellcykeln (Start), medan hämning av Ste5 garanterar distinkt uttryck av gener för antingen parningsvägen eller för cellcykelprogression.
Cellnäringstillväxt och storlekskontroll
De externa näringsämneskoncentrationerna är oerhört viktiga för att komma vidare genom startkontrollen. Tillgången på näringsämnen är starkt korrelerad till celltillväxtstorleken. Celler kommer inte att fortsätta om de inte når en viss storlek på grund av näringsbrist, vanligtvis kväve. Således tillbringar större celler mindre tid i startkontrollpunkten jämfört med mindre celler.