Cln3
| G1/S-specifika cyklin-CLN3- | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| identifierare | |||||||
| Organism | |||||||
| Symbol | CLN3 | ||||||
| Alt. symboler | YAL040C, WHI1, DAF1, FUN10 | ||||||
| Entrez | 851191 | ||||||
| RefSeq (mRNA) | NM_001178185 | ||||||
| RefSeq (Prot) | NP_009360 | ||||||
| UniProt | P13365 | ||||||
| Övriga uppgifter | |||||||
| Kromosom | 1: 0,07 - 0,07 Mb | ||||||
| |||||||
G1/S-specifikt cyklin Cln3 är ett protein som kodas av CLN3 -genen . Cln3-proteinet är ett spirande jäst G1-cyklin som styr tidpunkten för Start , punkten för engagemang för en mitotisk cellcykel. Det är en uppströmsregulator av de andra G1-cyklinerna, och det anses vara nyckelregulatorn som kopplar celltillväxt till cellcykelprogression. Det är ett 65 kD, instabilt protein; liksom andra cykliner fungerar den genom att binda och aktivera cyklinberoende kinas (CDK).
Cln3 i Startreglering
Cln3 reglerar Start , punkten där spirande jäst förbinder sig till G1/S-övergången och därmed en omgång av mitotisk division. Den identifierades först som en gen som styrde denna process på 1980-talet; forskning under de senaste decennierna har gett en mekanistisk förståelse av dess funktion. [ citat behövs ]
Identifiering av CLN3- genen
CLN3 - genen identifierades ursprungligen som whi1-1 -allelen i en screening för små mutanter av Saccharomyces cerevisiae (för Cln3:s roll i storlekskontroll, se nedan ). Denna skärm var inspirerad av en liknande studie i Schizosaccharomyces pombe , där Wee1 -genen identifierades som en hämmare av cellcykelprogression som bibehöll normal cellstorlek. Således WHI1 -genen först utföra en storlekskontrollfunktion analog med den hos Wee1 i pombe . Det visade sig dock senare att WHI1 faktiskt var en positiv regulator av Start , eftersom dess deletion fick celler att försena G1 och växa sig större än vildtypsceller. Den ursprungliga WHI1-1 -allelen (ändrad från whi1-1 eftersom den är en dominant allel) innehöll i själva verket en nonsensmutation som tog bort en nedbrytningsfrämjande PEST-sekvens från Whi1-proteinet och därmed accelererade G1-progression. WHI1 befanns vidare vara en cyklinhomolog, och det visades att samtidig radering av WHI1 - som döptes till CLN3 - och de tidigare identifierade G1-cyklinerna, CLN1 och CLN2 , orsakade permanent G1-stopp. Detta visade att de tre G1-cyklinerna var ansvariga för att kontrollera Start- inträde i spirande jäst. [ citat behövs ]
G1-S övergång
De tre G1-cyklinerna samarbetar för att driva jästceller genom G1-S-övergången, dvs att gå in i S-fas och påbörja DNA-replikation . Den nuvarande modellen av det genreglerande nätverket som styr G1-S-övergången visas i figur 1.
Nyckelmålen för G1-cyklinerna i denna övergång är transkriptionsfaktorerna SBF och MBF (visas inte i diagrammet), såväl som cyklinhämmaren Sic1 av B-typ . Cln-CDK aktiverar SBF genom att fosforylera och främja kärnexport av dess inhibitor, Whi5 , som associerar med promotorbunden SBF. Den exakta mekanismen för MBF-aktivering är okänd. Tillsammans främjar dessa transkriptionsfaktorer uttrycket av över 200 gener, som kodar för de proteiner som är nödvändiga för att utföra de biokemiska aktiviteterna i S-fasen. Dessa inkluderar S-fascyklinerna Clb5 och Clb6 , som binder CDK till att fosforylera S-fasmål. Emellertid hämmas Clb5,6-CDK-komplex av Sic1, så S-fasinitiering kräver fosforylering och nedbrytning av Sic1 av Cln1,2-CDK för att fortsätta fullt ut.
Cln3 aktiverar en Cln1,2 positiv återkopplingsslinga
Även om alla tre G1-cykliner är nödvändiga för normal reglering av Start och G1-S-övergången, verkar Cln3-aktivitet vara den avgörande faktorn vid S-fasinitiering, med Cln1 och Cln2 som fungerar för att aktivera det Cln3-baserade beslutet att transitstarta . Man fann tidigt att Cln3-aktivitet inducerade uttryck av Cln1 och Cln2. Dessutom var Cln3 en starkare aktivator Starttransit än Cln1 och Cln2, även om Cln3-CDK hade en inneboende svagare kinasaktivitet än de andra Clns. Detta indikerade att Cln3 var en uppströmsregulator av Cln1 och Cln2. Vidare fann man, som visas i figur 1, att Cln1 och Cln2 kunde aktivera sin egen transkription via SBF, vilket fullbordade en positiv återkopplingsslinga som kunde bidra till snabb aktivering och S-fasinträde. Sålunda Start transit förlita sig på att nå en tillräcklig nivå av Cln3-CDK-aktivitet för att inducera den positiva återkopplingsslingan för Cln1,2, som snabbt ökar SBF/MBF- och Cln1,2-aktiviteten, vilket möjliggör en switchliknande G1-S-övergång. Rollen av positiv feedback i denna process har ifrågasatts, men nya experiment har bekräftat dess betydelse för snabb inaktivering och kärnkraftsexport av Whi5 , som är den molekylära grunden för engagemang för S-fas.
Cln3 och cellstorlekskontroll
Som diskuterats ovan identifierades Cln3 ursprungligen som en regulator av spirande jästcellstorlek. Förtydligandet av mekanismerna genom vilka det reglerar Start har avslöjat ett sätt för det att koppla cellstorlek till cellcykelprogression, men frågor kvarstår om hur den faktiskt känner av cellstorlek. [ citat behövs ]
Start kräver en tröskelcellstorlek
Den enkla observationen att celler av en given typ är lika i storlek, och frågan om hur denna likhet upprätthålls, har länge fascinerat cellbiologer . Studiet av cellstorlekskontroll i spirande jäst började på allvar i mitten av 1970-talet, när regleringen av spirande jästcellcykeln först belystes av Lee Hartwell och kollegor. Seminalt arbete 1977 fann att jästceller bibehåller en konstant storlek genom att fördröja deras inträde i cellcykeln (som analyserats av knoppning) tills de har vuxit till en tröskelstorlek. Senare arbetade förfinade detta resultat för att visa att Start specifikt, snarare än någon annan aspekt av G1-S-övergången, styrs av storlekströskeln.
Translationell storleksavkänning
Att Start transit kräver uppnåendet av en tröskelcellstorlek innebär direkt att jästceller mäter sin egen storlek, så att de kan använda den informationen för att reglera Start . En favoriserad modell för hur jästceller, såväl som celler från andra arter, mäter sin storlek bygger på detekteringen av den totala translationshastigheten . Eftersom celltillväxt till stor del består av syntesen av ribosomer för att producera fler proteiner, bör den totala proteinproduktionshastigheten återspegla cellstorleken. Således kommer ett enstaka protein som produceras med en konstant hastighet i förhållande till den totala proteinproduktionskapaciteten att produceras i högre kvantiteter när cellen växer. Om detta protein främjar cellcykelprogression ( Start i fallet med jäst), kommer det att koppla cellcykelprogression till translationshastighet och därför cellstorlek. Viktigt är att detta protein måste vara instabilt, så att dess nivåer beror på dess nuvarande translationshastighet snarare än translationshastigheten över tiden. Dessutom, eftersom cellen växer i volym såväl som massa, kommer koncentrationen av denna storlekssensor att förbli konstant med tillväxten, så dess aktivitet måste jämföras med något som inte förändras med celltillväxt. Genomiskt DNA föreslogs tidigt som en sådan standard, eftersom det (per definition) är närvarande i en konstant mängd fram till starten av DNA-replikationen. Hur detta sker är fortfarande en viktig fråga i aktuella studier av storlekskontroll (se nedan ).
Före identifieringen av Cln3 och dess funktion indikerade samlade bevis att sådan translationell storleksavkänning fungerade i jäst. Först bekräftades det att den totala hastigheten för proteinsyntes per cell ökar med tillväxten, en grundläggande förutsättning för denna modell. Det visades senare att behandling med proteinsyntesinhibitorn cykloheximid fördröjde Start i jäst, vilket tyder på att translationshastigheten styrde Start . Slutligen visades det också att denna fördröjning inträffade även med korta pulser av cykloheximid, vilket bekräftar att ett instabilt aktiverande protein krävdes för Start .
Cln3 som storlekssensor
Modellen för spirande jäststorlekskontroll, där en tröskelstorlek för startinträde detekteras av en translationell storlekssensor, krävde ett "sizer"-protein; egenskaperna hos Cln3 gjorde den till den främsta kandidaten för den rollen från tidpunkten för upptäckten. För det första var det en kritisk startaktivator, eftersom G1-längden varierade omvänt med Cln3- uttryck och aktivitetsnivåer. För det andra uttrycktes det nästan konstitutivt under hela cellcykeln och i G1 i synnerhet - ovanligt för cykliner, som (som deras namn antyder) oscillerar i uttryck med cellcykeln. Dessa två egenskaper innebar att Cln3 kunde fungera som en startaktivator som berodde på den totala översättningshastigheten. Slutligen visades Cln3 också vara mycket instabil, den tredje nödvändiga egenskapen hos en translationell storleksmätare (som diskuterats ovan).
Således verkar Cln3 vara storlekssensorn i spirande jäst, eftersom den uppvisar de nödvändiga egenskaperna hos en translationell storleksmätare och är den mest uppströms regulatorn av Start . En kritisk fråga kvarstår dock om hur dess aktivitet görs storleksberoende. Som noterats ovan bör alla sensorer av translationell storlek vara i konstant koncentration, och därmed konstant aktivitet, i cytoplasman när celler växer. För att upptäcka dess storlek måste cellen jämföra det absoluta antalet sizer-molekyler med någon icke-växande standard, med genomet det självklara valet för en sådan standard. Man trodde ursprungligen att jäst åstadkom detta med Cln3 genom att lokalisera den (och dess mål, Whi5 ) till kärnan: kärnvolymen antogs skala med genominnehållet, så att en ökande koncentration av Cln3 i kärnan kunde indikera ökande Cln3-molekyler relativt till genomet. Emellertid har kärnan nyligen visat sig växa under G1, oavsett genominnehåll, vilket undergräver denna modell. Nyligen genomförda experiment har föreslagit att Cln3-aktivitet kan titreras direkt mot genomiskt DNA, genom dess DNA-bundna interaktion med SBF- Whi5 -komplex. Slutligen finns det andra modeller som inte är beroende av jämförelse av Cln3-nivåer med DNA. Man antyder ett icke-linjärt samband mellan total översättningshastighet och Cln3-översättningshastighet orsakad av en uppströms öppen läsram ; en annan tyder på att ökningen av Cln3-aktivitet i slutet av G1 är beroende av konkurrens om chaperonproteinet Ydj1, som annars håller Cln3-molekyler i det endoplasmatiska retikulumet .