Sic1
| Sic1- | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| identifierare | |||||||
| Symbol | Sic1 | ||||||
| Alt. symboler | YLR079W, SDB25, SIC1_YEAST, CDK-hämmare p40 | ||||||
| NCBI-genen | 850768 | ||||||
| UniProt | P38634 | ||||||
| |||||||
Sic1, ett protein , är en stökiometrisk hämmare av Cdk1 -Clb ( B-typ cykliner ) komplex i spirande jäst Saccharomyces cerevisiae . Eftersom B-typ cyklin-Cdk1-komplex är drivkrafterna för S- fasinitiering, förhindrar Sic1 för tidigt inträde i S-fas. Multisite- fosforylering av Sic1 antas tajma Sic1 ubiquitination och förstörelse, och i förlängningen, tidpunkten för S-fasinträde.
Cellcykelkontroll
I G1-fasen av cellcykeln binder Sic1 tätt till Cdc28-Clb-komplexet och hämmar det. Låg Cdc28-Clb-aktivitet leder till demontering av den mitotiska spindeln , sammansättning av det prereplikativa komplexet och initiering av knoppbildning i jäst.
Vid START-punkten i jästcellcykeln aktiverar G1- cyklinerna Cln3 , Cln1 och Cln2 Cdc28. Det aktiverade komplexet kommer att fosforylera Sic1 på flera ställen vilket leder till dess nedbrytning av SCF-komplexet . När Sic1 bryts ned hämmas inte längre Cdc28-Clb-komplexet och cellen kan gå in i S/M-fasen. Sålunda är Sic1-inaktivering väsentlig för övergång till S-fas (Fig. 1).
Cdc28 i komplex med cyklin av B-typ (Cdc28-Clb) fosforylerar Swi5 , transkriptionsfaktorn för Sic1 . Detta främjar exporten av Swi5 från kärnan till cytoplasman och undviker ytterligare transkription av cdk-hämmaren. Cdc28-Clb fosforylerar också alla Sic1-molekyler som fortfarande är tillgängliga och utlöser deras ubiquitin -beroende nedbrytning, precis som Cdc28-Cln. Höga Cdc28-Clb-nivåer initierar också DNA-replikation och duplicering av spindelpolkropparna (SPB). Då metafasspindeln och kromosomsegregering kan inträffa. Transkriptionen av Sic1 startar under telofas , förmedlad av Swi5. Aca2 är en annan transkriptionsfaktor av Sic1, men förblir inaktiv tills G1. I slutet av mitosen är Sic1 involverad i inaktiveringen av Cdc28-Clb.
Ubiquitin-beroende nedbrytning
För att kännas igen av Cdc4 i SCF-komplexet måste Sic1 fosforyleras , ofta av Cyclin-Cdk-komplex, åtminstone vid 6 av de 9 cdk-ställena (Fig. 2). Sic1 kan också fosforyleras av andra kinaser, såsom Pho85-Pc11, ett kinas som blir väsentligt när Cln1 och Cln2 är frånvarande. Sic1 har också en roll i svaret på osmostress. Det stressaktiverade proteinkinaset (SAPK) Hog1 fosforylerar Sic1 vid en enda rest vid karboxylterminalen . Detta leder till nedreglering av cyklinuttryck och Sic1-stabilisering som stoppar cellcykeln.
Fosforylering
Sic1 måste fosforyleras på flera platser för ubiquitination -driven nedbrytning (Fig. 2). De multipla fosforyleringarna krävs för att Sic1 ska rekryteras av Cdc4 till SCF-komplexet. Cdc4-substratigenkänningsmekanismen inkluderar interaktionen med konsensusbindande motiv på ytan av den vikta och fosforylerade Sic1, de så kallade Cdc4-fosfodegronerna (CPD). Det har visats att den optimala konsensussekvensen för Cdc4 är ett fosforylerat serin eller treonin följt av en prolin och en basisk aminosyra. Emellertid visar ingen av CPD:erna på ytan av Sic1 en sådan sammansättning. Därför är multipel fosforylering av Sic1 nödvändig för att få högaffinitetsbindning till Cdc4. Även om denna mekanism ser ineffektiv ut, ger den fördelar för en cell eftersom det är möjligt att mäta miljökoncentrationen av Cln/cdc28. Antalet fosforylerade ställen motsvarar koncentrationen av Cln/cdc28 och Sic1 kan betraktas som en sensor för detta protein. I motsats till de många skarpa övergångarna av ultrakänsliga kinaskaskadåterkopplingsslingor tillåter denna mekanism finjusterad reglering. Dessutom, eftersom multipla fosforyleringar krävs, är sannolikheten att Sic1 bryts ned slumpmässigt liten. Genom att använda multipel fosforylering av Sic1 utvecklade cellen en strategi för att i hög grad reglera uppkomsten av DNA-replikation som är absolut avgörande för att ge genetisk stabilitet.
En förenklad förståelse av regleringen av Sic1-nedbrytning involverar fosforylering av flera CDK-ställen, som består av optimala och suboptimala konsensusfosforyleringsmotiv. Nyligen genomförda studier utförda av Koivomagi et al. har avslöjat de många krångligheterna i multifosforyleringsreaktionen mellan cyklin-CDK-komplexet och Sic1-proteinet. Dessa studier avslöjar de viktiga egenskaperna hos Sic1 CDK-fosforyleringsställena, som inkluderar primingsställen, bindningsställen, degronpar, distansering av fosforyleringsställen och relativ platsplacering. Dessutom betonar studierna också påverkan av andra faktorer på Sic1-fosforylering, inklusive Cks1 -fosfobindningsfickan, cyklindockningsmotiv och Cdk1 -aktiva platsspecificitet. Alla dessa mekanismer bidrar till dynamiken i händelseförloppet som leder till Sic1-nedbrytning och initiering av S-fas .
Fungera
Förutom att vara en ofta förbisedd komponent i Cdk1-cyklinkomplexet är Cks1 avgörande för Sic1-multifosforylering och nedbrytning. Den fosfobindande fickan av Cks1 kan binda oberoende till fosforylerade CDK-ställen på Sic1. Dessutom är bindningsaffiniteten för Cks1 för fosfoseriner extremt svag, vilket i huvudsak gör Cks1-bindningen beroende av endast närvaron av fosfotreoniner. Sålunda, i Sic1-mutanter med ett Cdk1-fosforyleringsställe eller endast fosfoseriner närvarande, kan Cks1 inte ordentligt binda till substratet och främja Sic1-multifosforylering. Detta ger ett starkt argument för en processiv fosforyleringsmekanism istället för den tidigare teorin om en slumpmässig distributiv fosforyleringsmodell. Förutom att kräva treonin, kan Cks1-bindning till Sic1 förstärkas med införandet av en prolinrest i -2-positionen i förhållande till treoninresten.
Platspositionering
Sic1 är en molekyl med oordnade regioner, vilket hjälper till vid manipulering av fosforyleringsställesavstånd. För följande fynd, Koivomagi et al. använde en Sic1-konstruktion med ett optimalt T33-konsensusmotiv, som fungerar som det primära fosforyleringsstället, och ett suboptimalt motiv, som fungerar som ett sekundärt ställe.
När observationer begränsades till endast dubbelfosforylerade Sic1-konstruktioner observerades en tvåstegs fosforyleringsprocess, där det första steget var fosforylering på primärstället. Det sekundära stället måste dock vara beläget mot proteinets C-terminal i förhållande till det primära stället för att fosforylering ska ske. Fosforylering av sekundärt ställe är också känsligt för positionering. Toppfosforyleringshastigheter hittades mellan +12 till +16 aminosyraavstånd, med en distinkt ökning runt +10 till +12 intervallet och gradvis minskning över intervallet +20 till +30. Införandet av -2-prolinresten förstärker fosforyleringen både in vitro genom att utöka toppfosforyleringsintervallet, men ökar inte fosforyleringsaktiviteten vid avstånd mindre än +10. Denna expansion av toppfosforyleringsintervallet kan möjligen tillskrivas förbättrad bindning av primingstället till Cks1.
En enkel Sic1-konstruktion innehållande 5 fosforyleringsrester (1 primingsställe och två fosfodgronpar) visade att varje liten rörelse av primingstället kan ha betydande effekter på cellcykelprogression. Primerstället bör ligga inom intervallet +12 till +16 för båda resterna i fosfodgronparet för att maximera fosforyleringen.
Riktningsförmåga
Sicl-fosforylering initieras av G1-cyklinerna, Cln1,2, och fullbordas sedan av S-fascykliner, Clb5,6 (Fig. 1). Dockningsmotiven för cyklin deltar i Sic1-fosforyleringsdynamiken. S-fascykliner använder RXL-dockning medan G1-cykliner använder LLPP-dockning. Sic1-fosforyleringen ökar när RXL-motivet för Clb5 är +16 till +20 positioner i förhållande till det optimala CDK-motivet. RXL-positionering lokaliserad N-terminal till motivet ledde till försumbara mängder fosforylering. Däremot ökar Cln2-fosforyleringen att flytta LLPP-motivet bort från primingsstället, oavsett riktning.
Processivitet
Cks1-beroende multi-fosforylering sker på ett processivt eller semi-processivt sätt, vilket bevisas av avsaknaden av mellanliggande Sic1-fosforyleringstillstånd i normala celler. Denna processivitet är också beroende av närvaron av cyklindockningsstället eftersom ökat antal mutationer på detta ställe minskar nettofosforyleringshastigheten. Processiv fosforylering har två rimliga mekanismer där en enda bindningshändelse leder till fosforylering av två eller flera ställen. Den första mekanismen föreslår att, utan att dissociera från enzymkomplexet, det primära stället fosforyleras och omedelbart skiftas från det aktiva stället till Cks1-bindningsfickan för att möjliggöra ytterligare fosforylering av andra CDK-ställen. Den andra mekanismen föreslår att det fosforylerade primära stället binder till en annan plats och är kontinuerligt bundet medan andra CDK-ställen binder till det aktiva stället på ett sekventiellt sätt för multifosforylering. Simuleringar förutspår att sannolikheten för en andra fosforyleringshändelse efter den första, utan dissociation, är 40 % och 20-40 % för den första respektive andra mekanismen.
Sic1 är inriktat på nedbrytning av SCF (Cdc4), som känner igen Sic1 fosfodgronpar. Dessa fosfodgronpar är tätt placerade parade fosforyleringsrester som var och en har stark affinitet för Cdc4. I en Sic1-konstruktion med S69/S76/S80-klustret är processiv fosforylering av dessa fosfodgronpar beroende av Cdk1-platser. Clb5-processiviteten är beroende av T5- och T33-ställena, medan Cln2-processiviteten är beroende av T5. Återinförande av olika rester ledde till upptäckten av T33-resten som fungerar som en dockningsplats för T45/T48-fosfodgronparet, vilket kan främja Sic1-nedbrytning i viss utsträckning i frånvaro av andra fosfodgronpar.
Mekanism
Följande är en föreslagen mekanism av Koivomagi et al. av in vivo -kaskaden för att främja Sicl-fosforylering och nedbrytning.
I slutet av G1 hämmar Sic1 Clb5-Cdk1-komplexet och hämmar samtidigt sin egen nedbrytning. Fosforyleringskaskaden fortsätter genom Cln2-Cdk1-fosforylering av T5-primingsstället. Efter detta fosforyleras T33-, T45- och S76-resterna av Cln2-Cdk1, men inga degronpar fosforyleras. Dessa fosforylerade ställen förbättrar dock Clb5-Cdk1-dockning, vilket leder till ökad Sic1-fosforylering vid suboptimala ställen och en positiv återkopplingsslinga där Clb5-Cdk1-hämningen kontinuerligt minskar medan Sic1-nedbrytningen ökar.
Sic1-homolog i människor och sjukdomar
Proteinet p27Kip1 är en human homolog av Sic1, båda med en konserverad hämmande domän, men p27Kip1 hämmar G1-cykliner och inte cyklin B.
Det finns flera mänskliga sjukdomar som är kopplade till p27Kip1 och andra cyklinkinashämmare:
- Alla papillära mikrokarcinom (PMC) i sköldkörteln har ett lägre uttryck av p27Kip1 än normal sköldkörtelvävnad. Dessutom är uttrycket av p27Kip1 i mer aggressiva, metastaserande papillära mikrokarcinom kraftigt reducerat jämfört med icke-metastaserande mikrokarcinom. Dessa resultat tyder på att p27Kip1 fungerar som en tumörsuppressor .
- Kaposis sarkom är en typ av cancer som uppträder i kombination med AIDS och förmodligen orsakas av humant herpesvirus 8 (HHV8) . Detta virus uttrycker ett viralt cyklin som bygger ett komplex med Cdk6. Detta KSHV-cyklin-Cdk6-komplex fosforylerar och destabiliserar p27Kip1, vilket resulterar i en låg nivå av p27Kip1. Detta tyder på att nedbrytningen av p27Kip1 är associerad med utvecklingen av tumörerna.
- Patienter med gastriskt adenokarcinom ( magcancer ) har en högre chans att överleva om tumören har högt uttryck av p27Kip1. Lågt uttryck av p27Kip1 kan leda till tumörde-differentiering, ökad penetration genom magväggen, lymfkörtelmetastaser och framskridet tumörstadium.
Således är den humana Cdk-hämmaren p27Kip1 ett potentiellt tumörsuppressorprotein. Om dess uttryck reduceras kan resultatet bli oreglerad progression från G1 till S-fas som avreglerar celldelningen och förenklar bildandet av tumörer.