Spizellomyces punctatus

Spizellomyces punctatus
Vetenskaplig klassificering
Rike:	Svampar
Division:	Chytridiomycota
Klass:	Chytridiomycetes
Beställa:	Spizellomycetales
Familj:	Spizellomycetaceae
Släkte:	Spizellomyces
Arter:	S. punctatus
Binomialt namn
Spizellomyces punctatus (WJ Koch) DJS Barr

Spizellomyces punctatus är en chytridsvamp som lever i jord. Det är en saprotrofisk svamp som koloniserar ruttnande växtmaterial. Eftersom S. punctatus är en tidig divergerande svamp behåller den förfäders cellulära egenskaper som också finns hos djur och amöbor . Dess patogena släktingar, Batrachochytrium dendrobatidis och B. salamandrivorans , infekterar amfibier och orsakar global förlust av biologisk mångfald . Den rena kulturen av S. punctatus erhölls först av Koch (benämnd Phlyctochytrium punctatum) .

Genom

Genomet av S. punctatus stam DAOM BR117 sekvenserades under Origins of Multicellularity-projektet. Dess genomstorlek är cirka 24,13 Mb med ett GC-innehåll på 47,6%. Genomet har 9 424 förutsagda transkript och 8 952 förutsagda proteinkodande gener . DDBJ/EMBL/GenBank-anslutningsnumret är ACOE00000000.

Genetisk transformation

Agrobacterium-medierad transformation

Genetisk transformation av S. punctatus zoosporer av växtpatogen Agrobacterium tumefaciens EHA105-stam är framgångsrikt etablerad. Flera urvalsmarkörer har testats. Tillväxten av S. punctatus hämmas inte av Geneticin (G418), Puromycin och Phleomycin D10 (Zeocin) upp till 800 mg/L. 200 mg/L Hygromycin och 800 mg/L Nourseothricin (CloNAT) hämmar S. punctatus tillväxt fullständigt. Forskarna som utvecklar detta protokoll använder Hygromycin som urvalsmarkör. S. punctatus HSP70- och H2B- promotorer driver tillräckligt genuttryck för hygromycinresistens och GFP -uttryck testade i jäst. Styrt av starkare H2B- promotor, men GFP kanske inte framgångsrikt vikas i S. punctatus . Andra fluorescerande proteiner, inklusive tdTomato, mClover3, mCitrine och mCerulean3, är funktionella i S. punctatus.

Elektroporation

Ett högeffektivt elektroporationsprotokoll för S. punctatus och två besläktade chytrids-arter B. dendrobatidis och B. salamandrivorans har också etablerats. Den optimala spänningen för S. punctatus är 1000 V. Verkningsgraden är cirka 95 % med synkroniserade zoosporer. Elektroporering med osynkroniserade zoosporer kan också nå mer än 80 % effektivitet.

Livscykel

S.punctatus globulära zoosporer (3–5 mm) saknar cellvägg . Zoosporerna kan simma med en rörlig cilium (20–24 mm) eller krypa på ytor av aktinfyllda pseudopoder .

Under encystment demonteras cilium först via axoneme internalisering. Initieringen av denna process är aktinberoende. Axonemet förblir intakt under internaliseringen och det axonemala tubulinet bryts ned åtminstone delvis av proteasomen . Cellväggen bildas efter axoneme internalisering. Fem sätt av axoneme internalisering förekommer i S. punctatus : avskärning, upprullning i retraktion, lash-around retraktion, ciliarkompartment förlustretraktion och vesikulär retraktion. För det första kallas avskiljning som ciliumavlossning. För det andra sker upprullning i retraktion samtidigt med eller utan kortikal rotation och kallas body-twist retraction respektive rakt in retraktion. För det tredje, under lash-around-retraktion, lindas cilium runt utanför zoosporen med sammanslagning av ciliärmembran och plasmamembran. På 120 kPa fibronektinbelagda hydrogeler sker denna lash-around-retraktion inom en sekund . För det fjärde, för tillbakadragning av ciliärkompartmentförlust, följs ciliärmembranexpansion av sammanslagning av ciliäravdelningen med plasmamembranet. För det femte är vesikulär retraktion skapandet av en axonemeslinga-utbuktning i ciliärmembranet före internalisering.

Efter att cilium har dragits tillbaka, gror cystan och genererar ett groddrör . Groddröret förlängs sedan för att bilda det rhizoida systemet. Slutligen utvecklas cystan till ett sporangium , en reproduktiv struktur och mitos börjar. Efter fem till åtta gånger av synkron mitos bildas 32 – 256 zoosporer i sporangiet. Ciliogenes inträffar troligen före cellularisering. Efter cellularisering flyr zoosporerna från sporangiet under lämpliga miljöförhållanden.

Tidpunkten för cellcykeln har kvantifierats med hjälp av S. punctatus som uttrycker H2B-TdTomato kontrollerad av H2B -promotor under mikroskopi. Retraktionen av cilium och början av cysting sker inom en timme. Groddröret dyker upp om en till tre timmar. Den första mitosen inträffar om åtta till tolv timmar. Den avslutar fem till åtta gånger av synkron mitos på trettio timmar. Den genomsnittliga cellcykeln tar cirka 150 minuter. Varje kärnvapendivision är klar på 1 minut.

Mitokondriell 5' tRNA-redigering

Denna art är känd för att ha mitokondriell 5′ tRNA -redigering, en sällsynt modifiering som endast är känd för att existera i Amoebozoa-arterna Acanthamoeba castellanii och Chytridiomycota-arterna Harpochytrium 94, Harpochytrium 105, Monoblepharella curvatum phidium 15 och Hytridiomycota . S. punctatus mitokondriella genom kodar för åtta tRNA som känner igen lysin- , asparaginsyra- , tryptofan- , metionin- , tyrosin- , glutamin- , prolin- och leucinkodoner . tRNA ^Leu känner igen UAG -kodonet som leucin istället för stoppkodonet.

tRNA bildar sekundära strukturer som är sammansatta av spiralformade stammar. Förutspått från mtDNA , finns felparningar i de första tre nukleotiderna av de åtta tRNA-acceptorstammarna. Sekvensering av de mogna mitokondriella tRNA:erna visade ersättningen av pyrimidiner eller puriner med puriner (A till G, U till G, U till A och C till A) som återställer basparningen. Redigeringssidorna är alltid begränsade till de tre första positionerna.

Den mitokondriella 5'-tRNA-redigeringen av S.punctatus har bekräftats in vitro. Med användning av mitokondrieextrakt avlägsnas 5'-felmatchningarna av syntetiska tRNA-transkript och nukleotider införlivas i en 3'- till 5'-riktning genom att använda 3'-tRNA-sekvensen som mallar. Mönstren för mitokondriell 5'-tRNA-redigering liknar de som finns i A. castellanii.

Fytohormonreceptorhomologer

Etylen- och cytokininreceptorer i växter är histidinkinaser . Histidinkinaser i svampar är hybridhistidinkinaser på grund av fusionen av histidinkinas/histidinkinasliknande ATPas - katalytiska domäner (HK/HATPas-domäner) till mottagardomänen. Etylen- och cytokininreceptorhomologer finns också i flera flagellerade och oflagellerade svampsläkten, inklusive Spizellomyces . I allmänhet är dessa två fytohormoner signalmolekyler i växtbiotiska interaktioner. Etylen- och cytokininreceptorer i tidig diversifierande svamp kan spela viktiga roller för att kolonisera land.

Opsins

Två opsintyper finns: Typ 1-opsiner används av prokaryoter och av vissa alger (som en beståndsdel av channelrhodopsins ) och svampar , medan djur använder typ 2-opsiner . Typ 2-opsiner tillhör klass A-familjen av G-proteinkopplade receptorer . Båda typerna är sju-transmembranreceptorer och binder kovalent retinal som kromofor, vilket gör dem till fotoreceptorer som känner av ljus. Båda typerna är dock inte relaterade på sekvensnivå.

I andra svampar som Blastocladiella emersonii , en flagellerad tidigt divergerande svamp, används typ 1-opsiner för fototaxi . Men i S. punctatus existerar inte typ 1-opsiner, utan en förmodad typ 2-opsin. Den delar med andra G-proteinkopplade receptorer ett antal konserverade motiv och aminosyror inklusive lysinet som motsvarar rest 296 i nötkreatursrhodopsin, vilket är viktigt för retinal bindning och ljusavkänning. Det är som föreslagits av mallbaserad strukturmodellering också strukturellt likt djurtyp 2-operationer. Åtminstone beräkningsmässigt kan det binda retinal som kromofor. Den föredrar dock att binda 9-cis-retinal, till skillnad från de flesta klassiska djurtyp 2-opsiner, såsom boskapsrhodopsin, som binder 11-cis-retinal i mörkt tillstånd. Den biologiska funktionen hos S. punctatus opsin är dock okänd. Huruvida det verkligen är ett typ 2-opsin är också oklart, eftersom det saknas i en omfattande opsin-pyhlogeni som täcker så många opsiner som möjligt. I princip, om det är en fotoreceptor, kan det ha utvecklat ljuskänsligheten, oberoende.