Screening med hög genomströmning

Screeningrobotar med hög genomströmning

High-throughput screening ( HTS ) är en metod för vetenskapliga experiment som används speciellt för upptäckt av läkemedel och som är relevant för områdena biologi , materialvetenskap och kemi . Med hjälp av robotik , programvara för databehandling/kontroll, vätskehanteringsanordningar och känsliga detektorer, gör screening med hög genomströmning det möjligt för en forskare att snabbt utföra miljontals kemiska, genetiska eller farmakologiska tester. Genom denna process kan man snabbt känna igen aktiva föreningar, antikroppar eller gener som modulerar en viss biomolekylär väg. Resultaten av dessa experiment ger utgångspunkter för läkemedelsdesign och för att förstå icke-interaktionen eller rollen för en viss plats.

Förberedelse av analysplatta

En robotarm hanterar en analysplatta

Det viktigaste laboratorie- eller testkärlet för HTS är mikrotiterplattan , som är en liten behållare, vanligtvis engångsförpackning och gjord av plast, som har ett rutnät av små, öppna fördjupningar som kallas brunnar . I allmänhet har mikroplattor för HTS antingen 96, 192, 384, 1536, 3456 eller 6144 brunnar. Dessa är alla multipler av 96, vilket återspeglar den ursprungliga mikroplattan med 96 brunnar med åtskilda brunnar på 8 x 12 med 9 mm avstånd. De flesta av brunnarna innehåller testobjekt, beroende på experimentets karaktär. Dessa kan vara olika kemiska föreningar lösta t.ex. i en vattenlösning av dimetylsulfoxid (DMSO). Brunnarna kan också innehålla celler eller enzymer av någon typ. (De andra brunnarna kan vara tomma eller innehålla rent lösningsmedel eller obehandlade prover, avsedda att användas som experimentella kontroller .)

En screeninganläggning har vanligtvis ett bibliotek med lagertallrikar , vars innehåll är noggrant katalogiserat, och var och en av dem kan ha skapats av labbet eller erhållits från en kommersiell källa. Dessa lagerplattor i sig används inte direkt i experiment; istället skapas separata analysplattor efter behov. En analysplatta är helt enkelt en kopia av en lagerplatta, skapad genom att pipettera en liten mängd vätska (ofta mätt i nanoliter ) från brunnarna på en lagerplatta till motsvarande brunnar på en helt tom platta.

Reaktionsobservation

För att förbereda sig för en analys , fyller forskaren varje brunn på plattan med någon biologisk enhet som de vill utföra experimentet på, till exempel ett protein , celler eller ett djurembryo . Efter att en viss inkubationstid har passerat för att tillåta det biologiska materialet att absorbera, binda till eller på annat sätt reagera (eller misslyckas med att reagera) med föreningarna i brunnarna, görs mätningar över alla plattans brunnar, antingen manuellt eller med en maskin. Manuella mätningar är ofta nödvändiga när forskaren använder mikroskopi för att (till exempel) söka efter förändringar eller defekter i embryonal utveckling som orsakas av brunnarnas föreningar, och letar efter effekter som en dator inte lätt kan fastställa själv. Annars kan en specialiserad automatiserad analysmaskin köra ett antal experiment på brunnarna (som att lysa polariserat ljus på dem och mäta reflektivitet, vilket kan vara en indikation på proteinbindning). I det här fallet matar maskinen ut resultatet av varje experiment som ett rutnät med numeriska värden, där varje nummer avbildas till värdet som erhålls från en enda brunn. En analysmaskin med hög kapacitet kan mäta dussintals plattor inom loppet av några minuter så här och generera tusentals experimentella datapunkter mycket snabbt.

Beroende på resultaten av denna första analys kan forskaren utföra uppföljningsanalyser inom samma skärm genom att "plocka" vätska från källbrunnarna som gav intressanta resultat (känd som "träffar") till nya analysplattor och sedan köra om experimentet för att samla in ytterligare data om denna avsmalnande uppsättning, vilket bekräftar och förfinar observationer.

Automationssystem

Ett karusellsystem för att lagra analysplattor för hög lagringskapacitet och höghastighetsåtkomst

Automatisering är en väsentlig del av HTS användbarhet. Vanligtvis transporterar ett integrerat robotsystem som består av en eller flera robotar analysmikroplattor från station till station för tillsats av prov och reagens, blandning, inkubation och slutligen avläsning eller detektering. Ett HTS-system kan vanligtvis förbereda, inkubera och analysera många plattor samtidigt, vilket ytterligare påskyndar datainsamlingsprocessen. HTS-robotar som kan testa upp till 100 000 substanser per dag finns för närvarande. Automatiska koloniplockare plockar tusentals mikrobiella kolonier för genetisk screening med hög genomströmning. Termen uHTS eller ultra-high-throughput screening hänvisar (cirka 2008) till screening på över 100 000 föreningar per dag.

Experimentell design och dataanalys

Med möjligheten till snabb screening av olika föreningar (såsom små molekyler eller siRNA ) för att identifiera aktiva föreningar, har HTS lett till en explosion i datahastigheten som genererats under de senaste åren. Följaktligen är en av de mest grundläggande utmaningarna i HTS-experiment att få fram biokemisk betydelse från högar av data, som är beroende av utveckling och antagande av lämpliga experimentdesigner och analytiska metoder för både kvalitetskontroll och träffval. HTS-forskning är ett av de områden som har en funktion som beskrivs av John Blume, Chief Science Officer för Applied Proteomics, Inc., enligt följande: Snart, om en vetenskapsman inte förstår viss statistik eller rudimentär datahanteringsteknik, kan han eller hon kanske inte anses vara en sann molekylärbiolog och kommer därför helt enkelt att bli "en dinosaurie".

Kvalitetskontroll

Högkvalitativa HTS-analyser är avgörande i HTS-experiment. Utvecklingen av högkvalitativa HTS-analyser kräver integrering av både experimentella och beräkningsmetoder för kvalitetskontroll (QC). Tre viktiga sätt för QC är (i) bra plattdesign, (ii) valet av effektiva positiva och negativa kemiska/biologiska kontroller och (iii) utvecklingen av effektiva QC-mått för att mäta graden av differentiering så att analyser med sämre data kvalitet kan identifieras. En bra plattdesign hjälper till att identifiera systematiska fel (särskilt de som är kopplade till brunnsposition) och bestämma vilken normalisering som ska användas för att ta bort/minska effekten av systematiska fel på både QC och träffval.

Effektiva analytiska QC-metoder fungerar som en gatekeeper för analyser av utmärkt kvalitet. I ett typiskt HTS-experiment är en tydlig skillnad mellan en positiv kontroll och en negativ referens som en negativ kontroll ett index för god kvalitet. Många kvalitetsbedömningsåtgärder har föreslagits för att mäta graden av differentiering mellan en positiv kontroll och en negativ referens. Signal-till-bakgrundsförhållande, signal-till-brusförhållande, signalfönster, analysvariabilitetsförhållande och Z-faktor har antagits för att utvärdera datakvalitet. Strikt standardiserad medelskillnad ( SSMD ) har nyligen föreslagits för att bedöma datakvalitet i HTS-analyser.

Tryck val

En förening med önskad storlek på effekter i en HTS kallas en träff. Processen att välja träffar kallas träffval. De analytiska metoderna för träffval i skärmar utan replikat (vanligtvis i primära skärmar) skiljer sig från de med replikat (vanligtvis i bekräftande skärmar). Till exempel är z-score-metoden lämplig för skärmar utan replikat medan t-statistiken är lämplig för skärmar med replikat. Beräkningen av SSMD för skärmar utan replikat skiljer sig också från den för skärmar med replikat.

För träffval i primära skärmar utan replikat är de lätttolkbara genomsnittliga veckändringar, medelskillnad, procentuell hämning och procentuell aktivitet. De fångar dock inte datavariabilitet effektivt. Z-score-metoden eller SSMD, som kan fånga datavariabilitet baserat på ett antagande att varje förening har samma variabilitet som en negativ referens i skärmarna. Dock är extremvärden vanliga i HTS-experiment, och metoder som z-score är känsliga för extremvärden och kan vara problematiska. Som en konsekvens har robusta metoder som z*-poängmetoden, SSMD*, B-poängmetoden och kvantilbaserad metod föreslagits och antagits för träffval.

I en skärm med replikat kan vi direkt uppskatta variabiliteten för varje förening; som en konsekvens bör vi använda SSMD eller t-statistik som inte förlitar sig på det starka antagandet som z-poängen och z*-poängen förlitar sig på. En fråga med användningen av t-statistik och tillhörande p-värden är att de påverkas av både urvalsstorlek och effektstorlek. De kommer från testning för ingen större skillnad, och är därför inte utformade för att mäta storleken på sammansatta effekter. För träffval är det största intresset storleken på effekten i en testad substans. SSMD bedömer direkt storleken på effekter. SSMD har också visat sig vara bättre än andra vanliga effektstorlekar. Populationsvärdet för SSMD är jämförbart mellan experiment och därför kan vi använda samma cutoff för populationsvärdet för SSMD för att mäta storleken på sammansatta effekter.

Tekniker för ökad genomströmning och effektivitet

Unika fördelningar av föreningar över en eller flera plattor kan användas antingen för att öka antalet analyser per platta eller för att minska variansen av analysresultat, eller båda. Det förenklade antagandet som görs i detta tillvägagångssätt är att eventuella N-föreningar i samma brunn normalt inte kommer att interagera med varandra, eller analysmålet, på ett sätt som fundamentalt förändrar analysens förmåga att detektera verkliga träffar.

Föreställ dig till exempel en platta där förening A finns i brunnarna 1-2-3, förening B finns i brunnarna 2-3-4 och förening C finns i brunnarna 3-4-5. I en analys av denna platta mot ett givet mål skulle en träff i brunnarna 2, 3 och 4 indikera att förening B är det mest sannolika medlet, samtidigt som det ger tre mätningar av förening B:s effektivitet mot det specificerade målet. Kommersiella tillämpningar av detta tillvägagångssätt involverar kombinationer där inga två föreningar någonsin delar mer än en brunn, för att minska (andra ordningens) möjligheten för interferens mellan par av föreningar som screenas.

Senaste framstegen

Automatisering och analysformat med låga volymer utnyttjades av forskare vid NIH Chemical Genomics Center (NCGC) för att utveckla kvantitativa HTS (qHTS), ett paradigm för att farmakologiskt profilera stora kemiska bibliotek genom generering av fullständiga koncentration-svarsrelationer för varje förening. Med tillhörande kurvanpassning och keminformatikmjukvara ger qHTS-data halv maximal effektiv koncentration (EC50), maximal respons, Hill-koefficient (nH) för hela biblioteket, vilket möjliggör bedömning av begynnande strukturaktivitetsrelationer (SAR).

I mars 2010 publicerades forskning som visar en HTS-process som tillåter 1 000 gånger snabbare screening (100 miljoner reaktioner på 10 timmar) till en miljondel av kostnaden (med 10-7 gånger reagensvolymen) än konventionella tekniker med droppbaserad mikrofluidik. Droppar av vätska som separeras av olja ersätter mikroplattsbrunnar och möjliggör analys och träffsortering medan reagenser flödar genom kanaler.

Under 2010 utvecklade forskare ett kiselark med linser som kan placeras över mikrofluidiska arrayer för att möjliggöra fluorescensmätning av 64 olika utkanaler samtidigt med en enda kamera. Denna process kan analysera 200 000 droppar per sekund.

Under 2013 har forskare avslöjat ett tillvägagångssätt med små molekyler från växter. Generellt sett är det viktigt att tillhandahålla högkvalitativa proof-of-concept-valideringar tidigt i läkemedelsupptäcktsprocessen. Här är teknologier som möjliggör identifiering av potenta, selektiva och biotillgängliga kemiska sonder av avgörande intresse, även om de resulterande föreningarna kräver ytterligare optimering för utveckling till en farmaceutisk produkt. Nukleär receptor RORα, ett protein som har varit mål i mer än ett decennium för att identifiera potenta och biotillgängliga agonister, användes som ett exempel på ett mycket utmanande läkemedelsmål. Träffar bekräftas vid screeningsteget på grund av den klockformade kurvan. Denna metod är mycket lik den kvantitativa HTS-metoden (screening och träffbekräftelse samtidigt), förutom att användningen av detta tillvägagångssätt kraftigt minskar datapunktsnumret och kan enkelt screena mer än 100 000 biologiskt relevanta föreningar.

Där traditionell HTS-läkemedelsupptäckt använder renade proteiner eller intakta celler, är den senaste utvecklingen av teknologin förknippad med användningen av intakta levande organismer, som nematoden Caenorhabditis elegans och zebrafisk ( Danio rerio ).

Under 2016-2018 började plåttillverkare producera specialiserad kemi för att möjliggöra massproduktion av cellavstötande ytor med ultralåg vidhäftning, vilket underlättade den snabba utvecklingen av HTS-mottagliga analyser för att ta itu med upptäckt av cancerläkemedel i 3D-vävnader som organoider och sfäroider; ett mer fysiologiskt relevant format.

Ökad användning av HTS i akademin för biomedicinsk forskning

HTS är en relativt ny innovation som gjorts möjlig till stor del genom moderna framsteg inom robotik och höghastighetsdatorteknik. Det krävs fortfarande ett mycket specialiserat och dyrt screeninglabb för att driva en HTS-verksamhet, så i många fall kommer en liten till medelstor forskningsinstitution att använda tjänsterna från en befintlig HTS-anläggning istället för att sätta upp en själv.

Det finns en trend inom den akademiska världen att universiteten är sitt eget läkemedelsupptäckande företag. Dessa anläggningar, som normalt bara finns inom industrin, finns nu i allt större utsträckning även vid universiteten. UCLA , till exempel, har ett öppet HTS-laboratorium Molecular Screening Shared Resources (MSSR, UCLA), som kan screena mer än 100 000 föreningar per dag på rutinbasis. Open Access-policyn säkerställer att forskare från hela världen kan dra nytta av denna möjlighet utan långa förhandlingar om immateriella rättigheter. Med ett sammansatt bibliotek med över 200 000 små molekyler har MSSR ett av de största sammansatta däcken av alla universitet på västkusten. MSSR har också full funktionell genomik- kapacitet (genom bred siRNA, shRNA, cDNA och CRISPR) som är komplementära till småmolekylära ansträngningar: Funktionell genomik utnyttjar HTS-kapacitet för att utföra genom breda skärmar som undersöker funktionen av varje gen i intressesammanhang. genom att antingen slå ut varje gen eller överuttrycka den. Parallell tillgång till högkapacitetsskärm för små molekyler och en genombred skärm gör det möjligt för forskare att utföra målidentifiering och validering för en given sjukdom eller bestämning av verkningssättet på en liten molekyl. De mest exakta resultaten kan erhållas genom användning av "arrayade" funktionella genomikbibliotek, dvs varje bibliotek innehåller en enda konstruktion såsom ett enda siRNA eller cDNA. Funktionell genomik paras vanligtvis med screening med högt innehåll med hjälp av t.ex. epifluorescerande mikroskopi eller laserskanningscytometri.

University of Illinois har också en anläggning för HTS, liksom University of Minnesota. Life Sciences Institute vid University of Michigan inrymmer HTS-anläggningen i Center for Chemical Genomics. Columbia University har en HTS delad resursanläggning med ~300 000 olika små molekyler och ~10 000 kända bioaktiva föreningar tillgängliga för biokemisk, cellbaserad och NGS-baserad screening. Rockefeller University har ett HTS Resource Center HTSRC med öppen tillgång (The Rockefeller University, HTSRC), som erbjuder ett bibliotek med över 380 000 föreningar. Northwestern Universitys High Throughput Analysis Laboratory stödjer målidentifiering, validering, analysutveckling och screening av substanser. Det ideella Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute har också en långvarig HTS-anläggning i Conrad Prebys Center for Chemical Genomics som var en del av MLPCN. Det ideella Scripps Research Molecular Screening Center (SRMSC) fortsätter att tjäna akademin över institut efter MLPCN-eran. SRMSC uHTS-anläggningen upprätthåller en av de största bibliotekssamlingarna i den akademiska världen, för närvarande på över 665 000 små molekylenheter, och screenar rutinmässigt hela samlingen eller underbiblioteken till stöd för multi-PI-anslagsinitiativ.

I USA har National Institutes of Health eller NIH skapat ett rikstäckande konsortium av screeningcenter för små molekyler för att producera innovativa kemiska verktyg för användning i biologisk forskning. Molecular Libraries Probe Production Centers Network, eller MLPCN, utför HTS på analyser som tillhandahålls av forskarsamhället, mot ett stort bibliotek av små molekyler som finns i ett centralt molekylförråd.

Se även

Vidare läsning

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=High-throughput_screening&oldid=1136258535 "