Screening med högt innehåll

High-content screening (HCS), även känd som high-content analysis (HCA) eller cellomics , är en metod som används i biologisk forskning och läkemedelsupptäckt för att identifiera ämnen som små molekyler , peptider eller RNAi som förändrar fenotypen av en cell på önskat sätt. Därför är screening med högt innehåll en typ av fenotypisk screening som utförs i celler som involverar analys av hela celler eller komponenter av celler med samtidig avläsning av flera parametrar. HCS är relaterat till high-throughput screening (HTS), där tusentals föreningar testas parallellt med avseende på deras aktivitet i en eller flera biologiska analyser, men involverar analyser av mer komplexa cellulära fenotyper som utdata. Fenotypiska förändringar kan innefatta ökningar eller minskningar i produktionen av cellulära produkter såsom proteiner och/eller förändringar i cellens morfologi (visuella utseende). Därför involverar HCA vanligtvis automatiserad mikroskopi och bildanalys. Till skillnad från analys med högt innehåll innebär screening med högt innehåll en nivå av genomströmning, vilket är anledningen till att termen "screening" skiljer HCS från HCA, som kan ha högt innehåll men låg genomströmning.

inkuberas celler först med ämnet och efter en tid analyseras strukturer och molekylära komponenter i cellerna. Den vanligaste analysen innebär märkning av proteiner med fluorescerande taggar , och slutligen mäts förändringar i cellfenotyp med hjälp av automatiserad bildanalys . Genom användning av fluorescerande taggar med olika absorptions- och emissionsmaxima är det möjligt att mäta flera olika cellkomponenter parallellt. Vidare kan avbildningen detektera förändringar på subcellulär nivå (t.ex. cytoplasma vs. kärna vs. andra organeller ). Därför kan ett stort antal datapunkter samlas in per cell. Förutom fluorescerande märkning har olika märkningsfria analyser använts vid screening med högt innehåll.

Generella principer

En av tillämpningarna för HCS är upptäckten av nya läkemedelskandidater

High-content screening (HCS) i cellbaserade system använder levande celler som verktyg i biologisk forskning för att klargöra hur normala och sjuka celler fungerar. HCS används också för att upptäcka och optimera nya läkemedelskandidater. Screening med högt innehåll är en kombination av modern cellbiologi , med alla dess molekylära verktyg, med automatiserad högupplöst mikroskopi och robothantering. Celler exponeras först för kemikalier eller RNAi -reagens. Förändringar i cellmorfologi detekteras sedan med hjälp av bildanalys . Förändringar i mängden proteiner som syntetiseras av celler mäts med hjälp av en mängd olika tekniker, såsom de gröna fluorescerande proteinerna smälta till endogena proteiner, eller med fluorescerande antikroppar .

Tekniken kan användas för att avgöra om ett potentiellt läkemedel är sjukdomsmodifierande. Till exempel är G-proteinkopplade receptorer (GPCR) hos människor en stor familj av cirka 880 cellyteproteiner som omvandlar extracellulära förändringar i miljön till ett cellsvar, som att utlösa en ökning av blodtrycket på grund av frisättningen av en reglerande hormon i blodomloppet. Aktivering av dessa GPCR kan involvera deras inträde i celler och när detta kan visualiseras kan det vara grunden för en systematisk analys av receptorfunktion genom kemisk genetik , systematisk genomomfattande screening eller fysiologisk manipulation.

På cellulär nivå är parallell insamling av data om olika cellegenskaper, till exempel aktivitet av signaltransduktionskaskader och cytoskelettintegritet , den största fördelen med denna metod jämfört med den snabbare men mindre detaljerade screeningen med hög genomströmning . Medan HCS är långsammare, möjliggör rikedomen av insamlad data en mer djupgående förståelse av läkemedelseffekter.

Automatiserad bildbaserad screening möjliggör identifiering av små föreningar som förändrar cellulära fenotyper och är av intresse för upptäckten av nya läkemedel och nya cellbiologiska verktyg för att modifiera cellfunktion. Valet av molekyler baserat på en cellulär fenotyp kräver ingen förkunskap om de biokemiska mål som påverkas av föreningar. Identifieringen av det biologiska målet kommer emellertid att göra efterföljande preklinisk optimering och klinisk utveckling av föreningen betydligt lättare. Med tanke på den ökade användningen av fenotypisk/visuell screening som ett cellbiologiskt verktyg krävs metoder som möjliggör systematisk biokemisk målidentifiering om dessa molekyler ska vara till bred användning. Målidentifiering har definierats som det hastighetsbegränsande steget i kemisk genetik/screening med högt innehåll.

Instrumentation

En automatisk konfokal bildläsare

Screeningteknik med hög innehåll bygger huvudsakligen på automatiserad digital mikroskopi och flödescytometri , i kombination med IT-system för analys och lagring av data. Tekniken för "Höginnehåll" eller visuell biologi har två syften, för det första att få rumsligt eller temporärt löst information om en händelse och för det andra att automatiskt kvantifiera den. Rumsligt upplösta instrument är vanligtvis automatiserade mikroskop , och tidsupplösning kräver fortfarande någon form av fluorescensmätning i de flesta fall. Det betyder att många HCS-instrument är ( fluorescens )mikroskop som är kopplade till någon form av bildanalyspaket. Dessa tar hand om alla steg i att ta fluorescerande bilder av celler och ger snabb, automatiserad och opartisk bedömning av experiment.

HCS-instrument på marknaden idag kan separeras baserat på en rad specifikationer som avsevärt påverkar instrumentens mångsidighet och totala kostnad. Dessa inkluderar hastighet, en levande cellkammare som inkluderar temperatur- och CO 2 -kontroll (vissa har också fuktighetskontroll för längre sikt levande cellavbildning), en inbyggd pipett eller injektor för snabba kinetiska analyser och ytterligare bildlägen som konfokala, ljusa fält , faskontrast och FRET. En av de mest avgörande skillnaderna är om instrumenten är optiska konfokala eller inte. Konfokalmikroskopi sammanfattar som att avbilda/lösa upp en tunn skiva genom ett föremål och avvisa ur fokus ljus som kommer utifrån denna skiva. Konfokal avbildning möjliggör högre bildsignal till brus och högre upplösning än den mer vanligt använda epifluorescensmikroskopin . Beroende på instrumentet uppnås konfokalitet via laserskanning, en enkel snurrande skiva med nålhål eller slitsar, en dubbel snurrande skiva eller en virtuell slits. Det finns avvägningar av känslighet, upplösning, hastighet, fototoxicitet, fotoblekning, instrumentkomplexitet och pris mellan dessa olika konfokala tekniker.

Vad alla instrument delar är förmågan att ta, lagra och tolka bilder automatiskt och integreras i stora robotcell/mediumhanteringsplattformar.

programvara

Många skärmar analyseras med hjälp av bildanalysmjukvaran som medföljer instrumentet, vilket ger en nyckelfärdig lösning. Programvarualternativ från tredje part används ofta för särskilt utmanande skärmar eller där ett laboratorium eller en anläggning har flera instrument och vill standardisera till en enda analysplattform. Vissa instrumentprogramvara tillhandahåller massimport och export av bilder och data, för användare som vill göra sådan standardisering på en enda analysplattform utan att använda programvara från tredje part.

Ansökningar

Denna teknik möjliggör att ett (mycket) stort antal experiment kan utföras, vilket möjliggör explorativ screening. Cellbaserade system används främst inom kemisk genetik där stora, olika små molekylsamlingar systematiskt testas för sin effekt på cellulära modellsystem. Nya läkemedel kan hittas med hjälp av skärmar av tiotusentals molekyler, och dessa har lovande för framtiden för läkemedelsutveckling. Utöver läkemedelsupptäckten syftar kemisk genetik till att funktionalisera genomet genom att identifiera små molekyler som verkar på de flesta av de 21 000 genprodukterna i en cell. Teknik med högt innehåll kommer att vara en del av detta arbete som kan ge användbara verktyg för att lära sig var och när proteiner verkar genom att slå ut dem kemiskt. Detta skulle vara mest användbart för gen där knock-out-möss (som saknar en eller flera gener) inte kan göras eftersom proteinet krävs för utveckling, tillväxt eller på annat sätt dödligt när det inte finns där. Kemisk knock-out kan adressera hur och var dessa gener fungerar. Vidare används teknologin i kombination med RNAi för att identifiera uppsättningar av gener involverade i specifika mekanismer, till exempel celldelning. Här kan bibliotek av RNAis, som täcker en hel uppsättning av förutsagda gener inuti målorganismens genom användas för att identifiera relevanta undergrupper, vilket underlättar anteckningen av gener för vilka ingen tydlig roll har fastställts i förväg. De stora datamängder som produceras av automatiserad cellbiologi innehåller rumsligt upplösta, kvantitativa data som kan användas för att bygga modeller för systemnivå och simuleringar av hur celler och organismer fungerar. Systembiologiska modeller av cellfunktion skulle tillåta förutsägelse av varför, var och hur cellen reagerar på yttre förändringar, tillväxt och sjukdom.

Historia

Screeningteknologi med högt innehåll möjliggör utvärdering av flera biokemiska och morfologiska parametrar i intakta biologiska system.

För cellbaserade tillvägagångssätt kräver användbarheten av automatiserad cellbiologi en undersökning av hur automatisering och objektiv mätning kan förbättra experimenterandet och förståelsen av sjukdomar. För det första tar det bort utredarens inflytande i de flesta, men inte alla, aspekter av cellbiologisk forskning och för det andra gör det helt nya tillvägagångssätt möjliga.

I översikten använde klassisk 1900-talscellbiologi cellinjer odlade i kultur där experimenten mättes med mycket liknande det som beskrivs här, men där gjorde utredaren valet om vad som mättes och hur. I början av 1990-talet skapade utvecklingen av CCD- kameror ( charge coupled device cameras ) för forskning möjligheten att mäta funktioner i bilder av celler, som hur mycket protein som finns i kärnan, hur mycket som finns utanför. Sofistikerade mätningar följde snart med nya fluorescerande molekyler, som används för att mäta cellegenskaper som andra budbärare eller pH i interna cellfack. Den breda användningen av det gröna fluorescerande proteinet, en naturlig fluorescerande proteinmolekyl från maneter, accelererade sedan trenden mot cellavbildning som en vanlig teknik inom cellbiologi. Trots dessa framsteg valdes valet av vilken cell som skulle avbildas och vilken data som skulle presenteras och hur den skulle analyseras fortfarande av utredaren.

I analogi, om man föreställer sig en fotbollsplan och mattallrikar placerade tvärs över den, istället för att titta på dem alla, skulle utredaren välja en handfull nära poänglinjen och var tvungen att lämna resten. I denna analogi är fältet en vävnadsodlingsskål, plattorna cellerna växer på den. Även om detta var ett rimligt och pragmatiskt tillvägagångssätt automatisering av hela processen och analysen gör det möjligt att analysera hela populationen av levande celler, så att hela fotbollsplanen kan mätas.

Se även

Vidare läsning

externa länkar

Hämtad från " https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=High-content_screening&oldid=1113506937 "