Syntetisk genetisk array

Syntetisk genetisk arrayanalys ( SGA ) är en teknik med hög genomströmning för att utforska syntetiska dödliga och syntetiska sjuka genetiska interaktioner ( SSL ). SGA möjliggör systematisk konstruktion av dubbla mutanter med en kombination av rekombinanta genetiska tekniker , parnings- och selektionssteg. Med hjälp av SGA-metodik kan en frågegendeletionsmutant korsas till en hel genomdeletionsuppsättning för att identifiera eventuella SSL- interaktioner, vilket ger funktionell information om frågegenen och generna den interagerar med. En storskalig tillämpning av SGA där ~130 frågegener korsades till uppsättningen av ~5000 livskraftiga deletionsmutanter i jäst avslöjade ett genetiskt nätverk innehållande ~1000 gener och ~4000 SSL-interaktioner. Resultaten av denna studie visade att gener med liknande funktion tenderar att interagera med varandra och gener med liknande mönster av genetiska interaktioner kodar ofta för produkter som tenderar att fungera i samma väg eller komplex. Synthetic Genetic Array-analys utvecklades initialt med hjälp av modellorganismen S. cerevisiae . Denna metod har sedan utökats till att täcka 30 % av S. cerevisiae -genomet. Metodik har sedan dess utvecklats för att möjliggöra SGA-analys i S.pombe och E. coli .

Arrayed jäst som visar syntetiska dödliga interaktioner. Syntetiska dödliga interaktioner är de par av kolonier med minskad eller ingen tillväxt.

Bakgrund

Syntetisk genetisk array-analys utvecklades ursprungligen av Tong et al. 2001 och har sedan dess använts av många grupper som arbetar inom ett brett spektrum av biomedicinska områden. SGA använder hela genomet jäst knock-out set skapat av jäst genom deletion projektet.

Procedur

Syntetisk genetisk array-analys utförs i allmänhet med användning av koloniarrayer på petriplates vid standarddensiteter (96, 384, 768, 1536). För att utföra en SGA-analys i S. cerevisiae , korsas frågegendeletionen systematiskt med en deletionsmutant array (DMA) som innehåller alla livskraftiga knockout- ORF av jästgenomet (för närvarande 4786 stammar). De resulterande diploiderna sporuleras sedan genom överföring till ett medium som innehåller reducerat kväve. Den haploida avkomman genomgår sedan en serie selektionsplattor och inkubationer för att selektera för dubbla mutanter. Dubbelmutanterna screenas för SSL-interaktioner visuellt eller med hjälp av bildbehandlingsprogram genom att bedöma storleken på de resulterande kolonierna.

Replikering av jästkolonier under SGA-analys med hjälp av en pinningsrobot

Robotik

På grund av det stora antalet exakta replikeringssteg i SGA-analys används robotar i stor utsträckning för att utföra kolonimanipulationerna. Det finns några system speciellt utformade för SGA-analys, vilket avsevärt minskar tiden för att analysera en frågegen. I allmänhet har dessa en serie stift som används för att överföra celler till och från plattor, med ett system som använder engångsdynor av stift för att eliminera tvättcykler. Datorprogram kan användas för att analysera kolonistorlekarna från bilder av plattorna och därmed automatisera SGA-poängen och kemisk-genetikprofilering.

Steg för ett genomomfattande genetiskt screeningsystem med högt innehåll av jäst (SGA-vägkarta)

Det finns sex huvudkomponenter

1. Mutant samling
2. Material och verktyg för att hantera mutanterna
3. Bildanalyssystem
4. Automatiskt kvantifiering och poängsystem
5. Bekräftelsen närmar sig
6. Dataanalysverktyg

• Mutant samling

Det första steget är att samla in mutanterna och skapa ett mutantbibliotek antingen i fast eller flytande media. Solid media kan vara bättre eftersom det kan spara mycket tid. I ett tidigt skede gjordes mutantskapande genom homolog rekombinationsmetod. Vi har ett utmärkt mutantbibliotek för Saccharomyces cerevisiae , en välstuderad modellorganism.

Men om du försöker en ny jästmodell kan du behöva antingen en genomsekvensering och kan förutsäga möjlig ORF genom det goda referensjästgenomet (till exempel: med Saccharomyces cerevisiae). Tänk på ett specialfall: Om du inte har ett referensgenom bör du gå för transkriptom- och genomanalys av den nya modellorganismen.

• 
  Material och verktyg för att hantera mutanterna När du har ditt mutantbibliotek i fasta medier. Om mutanter finns i fasta medier har vi ordnat mutanterna med 1:3-ranson, dvs för en vildtyp till 3 mutanter array (varför? Vildtyp fungerar som en intern kontroll och i ett fast medium bör näringsämnen inte delas lika för att undvika partiskhet). När du har tagit bort mutanter från en enda gen kan du starta verktygen för att hantera mutanterna. I SGA kallas det "pinning". ROTOR-HAD versioner (kallad pinning robot) som används för att fästa jästmutanter. Denna maskin installerad med ett användarvänligt gränssnitt som hjälper till att fästa proverna från källplattor till experimentplattor

1. Bildanalyssystem
2. Automatiskt kvantifiering och poängsystem
3. Bekräftelsen närmar sig
4. Dataanalysverktyg

Se även

• Tetrad (genetik)
• Jäst två-hybrid
• Syntetisk dödlighet
• Syntetisk livskraft