Respirometri

Respirometri är en allmän term som omfattar ett antal tekniker för att erhålla uppskattningar av metabolismens hastigheter hos ryggradsdjur , ryggradslösa djur , växter , vävnader, celler eller mikroorganismer via ett indirekt mått på värmeproduktion ( kalorimetri ).

Hela djurs metaboliska hastigheter

Ett djurs metabolism uppskattas genom att bestämma hastigheten för koldioxidproduktion (VCO ₂ ) och syreförbrukning (VO ₂ ) hos enskilda djur, antingen i ett slutet eller ett öppet respirometrisystem. Två mått erhålls vanligtvis: standard (SMR) eller basal metabolisk hastighet (BMR) och maximal hastighet ( VO2max ). SMR mäts medan djuret är i vila (men inte sover) under specifika laboratorieförhållanden (temperatur, hydrering) och ämnesspecifika förhållanden (t.ex. storlek eller allometri ), ålder, reproduktionsstatus, postabsorberande för att undvika termisk effekt av mat ) . VO ₂ max bestäms vanligtvis under aerob träning vid eller nära fysiologiska gränser. Däremot hänvisar fältmetabolisk hastighet (FMR) till metabolismen hos ett ohämmat, aktivt djur i naturen. Hela djurs ämnesomsättning avser dessa mått utan korrigering för kroppsmassa. Om SMR- eller BMR-värden divideras med kroppsmassavärdet för djuret, benämns hastigheten massspecifik. Det är detta massspecifika värde som man vanligtvis hör i jämförelser mellan arter.

Sluten respirometri

Respirometri beror på principen "det som går in måste komma ut". Överväg ett slutet system först. Föreställ dig att vi placerar en mus i en lufttät behållare. Luften som är förseglad i behållaren innehåller initialt samma sammansättning och proportioner av gaser som fanns i rummet: 20,95 % O ₂ , 0,04 % CO ₂ , vattenånga (den exakta mängden beror på lufttemperaturen, se daggpunkt ), 78 % (ungefär) N ₂ , 0,93 % argon och en mängd olika spårgaser som utgör resten (se Jordens atmosfär ) . När tiden går musen i kammaren CO ₂ och vattenånga, men extraherar O ₂ ur luften i proportion till dess metaboliska behov. Så länge vi känner till systemets volym är därför skillnaden mellan koncentrationerna av O ₂ och CO ₂ i början när vi förseglade musen i kammaren (baslinje- eller referensförhållandena) jämfört med mängderna som finns efter musen har andats luften vid ett senare tillfälle måste vara de mängder CO ₂ /O ₂ som produceras/konsumeras av musen . Kväve och argon är inerta gaser och därför är deras delmängder oförändrade av musens andning. I ett slutet system kommer miljön så småningom att bli hypoxisk .

Öppen respirometri

För ett öppet system inkluderar designbegränsningar utspolningsegenskaper hos djurkammaren och gasanalysatorernas känslighet. Grundprincipen förblir dock densamma: Det som går in måste komma ut. Den primära skillnaden mellan ett öppet och ett slutet system är att det öppna systemet strömmar luft genom kammaren (dvs luft trycks eller dras av pumpen) med en hastighet som ständigt fyller på O 2 som töms av djuret samtidigt som CO ₂ och _vatten avlägsnas ånga som produceras av djuret. Den volymetriska flödeshastigheten måste vara tillräckligt hög för att säkerställa att djuret aldrig förbrukar allt syre som finns i kammaren samtidigt som hastigheten måste vara tillräckligt låg så att djuret förbrukar tillräckligt med O 2 _för detektion. För en 20 g mus skulle flödeshastigheter på cirka 200 ml/min genom 500 ml behållare ge en bra balans. Vid denna flödeshastighet förs ca 40 ml O _{2 till kammaren och hela volymen luft i kammaren byts ut inom 5 minuter.} För andra mindre djur kan kammarvolymerna vara mycket mindre och flödeshastigheterna skulle också justeras ned. Observera att för varmblodiga eller endotermiska djur ( fåglar och däggdjur ), kommer kammarstorlekar och/eller flödeshastigheter att väljas för att tillgodose deras högre metaboliska hastigheter.

Beräkningar

Beräkning av hastigheter för VO ₂ och/eller VCO ₂ kräver kunskap om flödeshastigheterna in i och ut ur kammaren, plus fraktionella koncentrationer av gasblandningarna in i och ut ur djurkammaren. I allmänhet beräknas metabola hastigheter från steady-state-förhållanden (dvs. djurets metaboliska hastighet antas vara konstant). För att veta hur mycket syre som förbrukas måste man känna till flödesmätarens placering i förhållande till djurkammaren (om den är placerad före kammaren är flödesmätaren "uppströms", om den är placerad efter kammaren är flödesmätaren "nedströms" "), och om reaktiva gaser är närvarande (t.ex. CO ₂ , vatten , metan , se inert gas ).

För ett öppet system med uppströms flödesmätare, vatten (t.ex. vattenfritt kalciumsulfat ) och CO ₂ avlägsnat före syreanalysatorn , är en lämplig ekvation

{\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}\cdot ({\mathit {F }}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)}{1-{\mathit {F}}_{ex}O2}}}}

För ett öppet system med nedströms flödesmätare, vatten och CO ₂ avlägsnat före syreanalysatorn , är en lämplig ekvation

{\ce {VO2={\frac {{\mathit {FR}}\cdot ({\mathit {F }}_{in}O2-{\mathit {F}}_{ex}O2)}{1-{\mathit {F}}_{in}O2}}}}

var

FR är den volymetriska flödeshastigheten justerad till STP (se Standardvillkor för temperatur och tryck )
F _i O ₂ är den fraktionella mängden syre som finns i den aktuella luftströmmen (baslinjen eller referensen), och
F _ex O ₂ är den fraktionella mängden syre som finns i ex -strömmen av luftströmmen (vad djuret har konsumerat i förhållande till baslinjen per tidsenhet).

Till exempel kan värden för BMR för en 20 g mus ( Mus musculus ) vara FR = 200 ml/min, och avläsningar av fraktionerad koncentration av O ₂ från en syreanalysator är F _i O ₂ = 0,2095, F _ex O ₂ = 0,2072 . Den beräknade syreförbrukningen är 0,58 ml/min eller 35 ml/timme. Om vi antar en förbränningsentalpi för O ₂ på 20,1 joule per milliliter, skulle vi sedan beräkna värmeproduktionen (och därmed metabolismen) för musen som 703,5 J/h.

Respirometriutrustning

För system med öppet flöde är listan över utrustning och delar lång jämfört med komponenterna i ett slutet system, men den största fördelen med det öppna systemet är att det tillåter kontinuerlig registrering av metabolisk hastighet. Risken för hypoxi är också mycket mindre i ett öppet system.

Pumpar för luftflöde

Vakuumpump : en pump behövs för att trycka (dvs. uppströms läge) eller dra (dvs. nedströms läge) luft in i och genom djurkammaren och respirometrins genomströmningssystem.
Delprovspump: För att dra luft genom analysatorerna används en liten, stabil, pålitlig pump.

Flödesmätare och flödesregulatorer

Bubbelflödesmätare: Ett enkelt, men mycket noggrant sätt att mäta flödeshastigheter, innebär att man skjuter tvålfilmsbubblor upp i glasrör mellan märken med känd volym. Glasröret är anslutet i botten (för push-system) eller upptill (för pull-system) till luftströmmen. En liten gummipipett glödlampa fäst vid basen av röret fungerar som både en reservoar och leveranssystem för såpbubblorna. Driften är enkel. Blöt först glasytan längs med bubblornas väg (t.ex. tryck på glödlampan så att stora mängder tvål trycks upp i glaset av luftflödet) för att ge en praktiskt taget friktionsfri yta. För det andra, nyp ihop glödlampan så att en ren bubbla produceras. Med ett stoppur i handen, registrera hur lång tid det tar för bubblan att färdas mellan märkena på glaset. Notera volymen registrerad på den övre markeringen (t.ex. 125 = 125 ml), dividera volymen med tiden som krävs för att färdas mellan markeringarna och resultatet är flödeshastigheten (ml/s). Dessa instrument kan köpas från en mängd olika källor, men de kan också konstrueras av lämplig storlek, volymetriska glaspipetter .
Akrylflödesmätare: Under vissa omständigheter med höga flödeshastigheter kan vi använda enkla akrylflödesmätare (0–2,5 liter/min) för att kontrollera flödeshastigheterna genom de metaboliska kamrarna. Mätarna är placerade uppströms från de metaboliska kamrarna. Flödesmätarna är enkla att använda men bör kalibreras två gånger dagligen för användning i respirometrisystemet: en gång innan registreringen börjar (men efter att djuret har förseglats inne i kammaren!!) och igen i slutet av registreringen (före djuret) tas bort från kammaren). Kalibrering måste göras med en bubbelflödesmätare eftersom kalibreringsmärkena på akrylmätarna endast är ungefärliga. För korrekt kalibrering av flödeshastigheter kom ihåg att både barometertryck och temperatur för luften som strömmar genom flödesmätaren (som vi antar är lika med rumstemperatur) måste registreras.
Massflödesmätare : Ekvationerna som krävs för att beräkna hastigheten för syreförbrukning eller koldioxidproduktion antar att flödeshastigheterna in i och ut ur kamrarna är exakt kända. Vi använder massflödesmätare som har fördelen att ge flödeshastigheter oberoende av temperatur och lufttryck. Därför kan dessa flödeshastigheter anses vara korrigerade till standardförhållanden (Standard Temperature Pressure). Vi mäter och kontrollerar bara flödet på en plats - nedströms från kammaren. Därför måste vi anta att inflödet och utflödet är identiska. Men under konstruktionen av respirometrisystemet måste flödeshastigheten mätas i alla steg, över alla anslutningar, för att verifiera flödets integritet.
Nålventiler : Massflödesmätare kan köpas med massflödesregulatorer som tillåter inställning av flödeshastigheter. Dessa är dock dyra. Respirometriforskning kommer ofta att försöka mäta mer än ett djur åt gången, vilket skulle kräva en kammare per djur och därmed kontrollerat flöde genom varje kammare. En alternativ och mer kostnadseffektiv metod för att styra flödet skulle vara via nålventiler av rostfritt stål eller kolstål. Nålventiler plus massflödesmätare ger ett kostnadseffektivt sätt att uppnå önskade flödeshastigheter. Ventilerna kostar cirka 20 dollar.

Slang och kammare

Slangar och anslutningar: Olika typer av slangar kan användas för att ansluta komponenterna i respirometrisystemet till och från djurkammaren. En mängd olika typer av flexibla slangar kan användas, beroende på systemets egenskaper. Acetyl-, Bev-A-Line-, Kynar-, nylon-, Tygon-slangar och kopplingar kan användas i områden i systemet där oxiderande atmosfärer är låga (t.ex. endast bakgrundsnivåer av ozon); Teflonrör skulle rekommenderas om det finns en förväntning om att det finns avsevärda mängder ozon eftersom det är inert mot ozon. Teflonrör är dyrare och saknar flexibilitet.
Metaboliska kamrar: Kammare kan vara glasburkar med gummiproppar för lock; injektionssprutor för små djur och insekter; eller tillverkad av plexiglas . Helst bör kamrarna vara konstruerade av inerta material; till exempel kan akrylplasterna absorbera O ₂ och kan vara ett dåligt val för respirometri med mycket små insekter. Kammare måste vara konstruerade på ett sätt som ger snabb blandning av gaser i kammaren. Den enklaste metaboliska kammaren för ett litet ryggradsdjur kan vara en glasburk med en propp. Stopparna är försedda med två portar: korta förlängningar av teflon-slangar tillhandahålls för linjeanslutningar. Teflonrörsförlängningar skjuts genom skottet och ledningsanslutningen avslutas genom att fästa en liten slangklämma på basen av teflonrörförlängningen. Dessutom bör en förlängning av inloppsporten inuti burken tillhandahållas - detta säkerställer att djurets utandningsgaser inte sköljs bort av inflödesströmmen. Djuret tätas inuti och gummiproppen hålls på plats med kardborreband . Om ett uppströms system används kommer eventuellt läckage av metabola kammare att resultera i förlust av djurluft och därför en underskattning av djurets ämnesomsättning. När man stänger ett djur inuti en metabolisk kammare måste man vara uppmärksam på tätningen. För att säkerställa täta förslutningar innan du stänger locket, arbeta in proppen ordentligt i burken och se till att den är jämn. Använd 1–2 remmar (2 är bättre) och dra åt hårt. Akryl (plexiglas) kammare kommer att konstrueras för vissa användningsområden, men exakt ingenjörskonst kommer att behövas för att säkerställa korrekt sittplats; packningar kommer att hjälpa, och klok användning av tättslutande klämmor kommer att minimera läckage.
Skurrör: Vatten före och efter djurkammaren måste tas bort. Ett arrangemang skulle använda en stor akrylkolonn av Drierite (8 mesh (skala) , dvs relativt grov) uppströms (före tryckpumpen, före djurkammaren) för att torka inkommande luftström och flera rör med mindre mesh (10–20, dvs. , relativt fin) Drierite för att ta bort vatten efter djurkammaren. För att förbereda ett skurrör, se till att det finns en liten mängd bomull i vardera änden av röret för att förhindra dammpartiklar från att färdas till analysatorerna. Använd små mängder bomull, säg cirka 0,005 g, precis tillräckligt för att hålla dammet borta från slangen. Stora mängder bomull blockerar luftflödet när/om det blir fuktigt. Häll Drieriten i röret med en tratt, knacka röret på bänken för att packa kornen tätt (för att öka ytan – luft + vatten forsar genom lös Drierite, vilket kräver frekventa byten av skrubber) och täck av med en liten mängd bomull. För att avlägsna koldioxid] före och efter djurkammaren, används Ascarite II (Ascarite II är ett registrerat varumärke som tillhör Arthur H. Thomas Co.). Ascarite II innehåller NaOH, som är frätande (så får inga på huden och håll borta från vatten). Ett skurrör förbereds genom att placera en liten mängd bomull i röränden, fylla en tredjedel av vägen med 10–20 mesh Drierite, lägga till en liten mängd bomull, sedan ytterligare en tredjedel av röret med Ascarite II, ytterligare ett lager bomull, följt av mer Drierite och täck tuben med ytterligare en liten mängd bomull. Knacka röret på bänken när varje lager läggs till för att packa kornen. Obs: Driereite kan användas om och om igen (efter uppvärmning i en ugn), även om det indikerar att Drierite kommer att förlora färg vid upprepad torkning; Ascarite II används en gång och kommer att betraktas som ett farligt avfall .

Analysatorer

Koldioxidanalysator : CO ₂ -analysatorer använder vanligtvis infrarödbaserade detektionsmetoder för att dra fördel av det faktum att CO ₂ kommer att absorbera infrarött ljus och återutsända ljus vid något längre våglängder. Panelmätaren på analysatorn visar över hela 0,01 – 10 % CO ₂ -intervall och en spänningsutgång som är proportionell mot CO ₂ -koncentrationen genereras också för dataregistrering.
Syreanalysator : Syreanalysatorer som är lämpliga för respirometri använder en mängd olika syresensorer , inklusive galvaniska ("omgivningstemperatur"), paramagnetiska , polarografiska ( Clark -typ elektroder) och zirkonium ("hög temperatur") sensorer. Galvaniska O ₂ -analysatorer använder en bränslecell som innehåller en sur elektrolyt , en tungmetallanod och ett tunt gaspermeabelt membran . Eftersom partialtrycket för O2 _nära anoden är noll, drivs O2 genom _diffusion till anoden via membranet med en hastighet som är proportionell mot omgivande O2- _partialtryck . Bränslecellen producerar en spänning linjärt proportionell mot O ₂ partialtrycket vid membranet. Så länge skåpets temperatur är stabil och förutsatt att luftflödet över bränslecellen är stabilt och inom räckvidd, kommer responsen att vara 0,01 % eller bättre beroende på elektronik, mjukvara och andra överväganden.

Slutligen skulle ett datordatainsamlings- och kontrollsystem vara ett typiskt tillägg för att komplettera systemet. Istället för en sjökortsskrivare görs kontinuerliga registreringar av syreförbrukning och/eller koldioxidproduktion med hjälp av en analog-till-digital-omvandlare kopplad till en dator. Programvaran fångar, filtrerar, konverterar och visar signalen som är lämplig för försöksledarens behov. En mängd olika företag och individer betjänar respirometrisamhället (t.ex. Sable Systems , Qubit Systems, se även Warthog Systems).

Mitokondriella metaboliska hastigheter

Inuti kroppen levereras syre till celler och i cellerna till mitokondrier , där det förbrukas i processen och genererar det mesta av den energi som organismen kräver. Mitokondriell respirometri mäter syreförbrukningen av mitokondrierna utan att involvera ett helt levande djur och är det främsta verktyget för att studera mitokondriernas funktion. Tre olika typer av prover kan utsättas för sådana respirometriska studier: isolerade mitokondrier (från cellkulturer, djur eller växter); permeabiliserade celler (från cellkulturer); och permeabiliserade fibrer eller vävnader (från djur). I de två senare fallen görs cellmembranet permeabelt genom tillsats av kemikalier som selektivt lämnar mitokondriella membran intakt. Därför kan kemikalier som vanligtvis inte skulle kunna passera cellmembranet direkt påverka mitokondrierna. Genom permeabiliseringen av cellmembranet slutar cellen att existera som en levande, definierad organism, och lämnar bara mitokondrierna som fortfarande funktionella strukturer. Till skillnad från heldjursrespirometri sker mitokondriell respirometri i lösning, dvs provet suspenderas i ett medium. Idag utförs mitokondriell respirometri huvudsakligen med en sluten kammare.

System med slutna kammare

Provet suspenderat i ett lämpligt medium placeras i en hermetiskt sluten metabolisk kammare. Mitokondrierna förs in i definierade "tillstånd" genom sekventiell tillsats av substrat eller inhibitorer. Eftersom mitokondrierna förbrukar syre sjunker syrekoncentrationen. Denna förändring av syrekoncentrationen registreras av en syresensor i kammaren. Från hastigheten för syreminskningen (med hänsyn till korrigering för syrediffusion) kan mitokondriernas andningshastighet beräknas.

Ansökningar

Grundforskning

Funktionen av mitokondrier studeras inom området bioenergetik . Funktionella skillnader mellan mitokondrier från olika arter studeras med respirometri som en aspekt av jämförande fysiologi .

Tillämpad forskning

Mitokondriell respirometri används för att studera mitokondriell funktionalitet vid mitokondriella sjukdomar eller sjukdomar med (misstänkt) stark koppling till mitokondrier, t.ex. diabetes mellitus typ 2 , fetma och cancer . Andra användningsområden är t.ex. idrottsvetenskap och sambandet mellan mitokondriell funktion och åldrande .

Utrustning

Den vanliga utrustningen inkluderar en förslutningsbar metabolisk kammare, en syresensor och enheter för dataregistrering, omrörning, termostatisering och ett sätt att införa kemikalier i kammaren. Som beskrivits ovan för respirometri hos hela djur är valet av material mycket viktigt. Plastmaterial är inte lämpliga för kammaren på grund av deras syrelagringskapacitet. När plastmaterial är oundvikliga (t.ex. för o-ringar, beläggningar av omrörare eller proppar) kan polymerer med mycket låg syrepermeabilitet (som PVDF i motsats till t.ex. PTFE ) användas. Återstående syrediffusion in i eller ut ur kammarmaterialen kan hanteras genom att korrigera de uppmätta syreflödena för det instrumentella syrebakgrundsflödet. Hela instrumentet som består av de nämnda komponenterna kallas ofta en oxygraph. De företag som tillhandahåller utrustning för heldjursrspirometri som nämns ovan är vanligtvis inte involverade i mitokondriell respirometri. Samhället betjänas till vitt varierande pris- och sofistikerade nivåer av företag som Oroboros Instruments, Hansatech, Respirometer Systems & Applications, YSI Life Sciences eller Strathkelvin Instruments.

Se även

externa länkar