Immunogold-märkning
Immunogold-märkning eller Immunogold-färgning (IGS) är en färgningsteknik som används i elektronmikroskopi . Denna färgningsteknik är en motsvarighet till den indirekta immunfluorescenstekniken för synligt ljus. Kolloidala guldpartiklar är oftast fästa till sekundära antikroppar som i sin tur är fästa till primära antikroppar utformade för att binda ett specifikt antigen eller annan cellkomponent . Guld används för sin höga elektrondensitet som ökar elektronspridningen för att ge "mörka fläckar" med hög kontrast.
Används först 1971, immunogoldmärkning har applicerats på både transmissionselektronmikroskopi och svepelektronmikroskopi, såväl som ljusfältsmikroskopi . Märkningstekniken kan anpassas för att särskilja flera objekt genom att använda guldpartiklar av olika storlek.
Immunogold-märkning kan introducera artefakter, eftersom guldpartiklarna ligger en bit från det märkta föremålet och mycket tunn sektionering krävs under provberedningen.
Historia
Immunogold-märkning användes först 1971 av Faulk och Taylor för att identifiera Salmonella- antigener . Den användes först i transmissionselektronmikroskopi (TEM) och var särskilt användbar för att framhäva proteiner som finns i låga densiteter, såsom vissa cellyteantigener. När upplösningen av svepelektronmikroskopi (SEM) ökade, ökade också behovet av etiketter i nanopartikelstorlek som immunogold. 1975 visualiserade Horisberger och medarbetare framgångsrikt guldnanopartiklar med en diameter på mindre än 30 nm och detta blev snart en etablerad SEM-teknik.
Metod
Först skärs en tunn del av provet, ofta med hjälp av en mikrotom . Olika andra stadier av provberedningen kan då äga rum.
Det preparerade provet inkuberas sedan med en specifik antikropp utformad för att binda molekylen av intresse. Därefter tillsätts en sekundär antikropp som har guldpartiklar fästa, och den binder till den primära antikroppen. Guld kan också bindas till protein A eller protein G istället för en sekundär antikropp, eftersom dessa proteiner binder däggdjurs IgG Fc-regioner på ett ospecifikt sätt.
Den elektrontäta guldpartikeln kan nu ses under ett elektronmikroskop som en svart prick, indirekt märkning av molekylen av intresse.
Märkning av flera objekt
Immunogold-märkning kan användas för att visualisera mer än ett mål samtidigt. Detta kan uppnås i elektronmikroskopi genom att använda två guldpartiklar av olika storlek. En förlängning av denna metod använde tre guldpartiklar av olika storlek för att spåra lokaliseringen av regulatoriska peptider . En mer komplex metod för märkning av flera ställen involverar märkning av motsatta sidor av en antigen plats separat, immunogoldpartiklarna fästa på båda sidorna kan sedan ses samtidigt.
Används i ljusfältsmikroskopi
Även om immunogoldmärkning vanligtvis används för transmissionselektronmikroskopi, när guldet är "silverförstärkt" kan det ses med ljusfältsmikroskopi . Silverförstärkningen ökar partikelstorleken, vilket också gör svepelektronmikroskopi möjlig. För att producera de silverförstärkta guldpartiklarna placeras kolloidala guldpartiklar i en sur förstärkande lösning innehållande silverjoner . Guldpartiklar fungerar sedan som ett kärnbildningsställe och silver avsätts på partikeln. Ett exempel på tillämpningen av silverförstärkt immunogoldmärkning (IGSS) var vid identifieringen av patogenen Erwinia amylovora .
Begränsningar
En inneboende begränsning för immunogoldtekniken är att guldpartikeln är omkring 15-30 nm bort från det ställe till vilket den primära antikroppen är bunden (när man använder en primär och sekundär antikroppsmärkningsstrategi) . Den exakta platsen för målmolekylen kan därför inte exakt beräknas. Guldpartiklar kan skapas med en diameter på 1 nm (eller lägre), men en annan begränsning realiseras då - vid dessa storlekar blir guldetiketten svår att skilja från vävnadsstrukturen.
Tunna sektioner krävs för immunogoldmärkning och dessa kan producera vilseledande bilder; en tunn skiva av en cellkomponent kanske inte ger en korrekt bild av dess tredimensionella struktur . Till exempel kan en mikrotubuli visas som en "spets" beroende på vilket plan sektioneringen inträffade. För att övervinna denna begränsning kan seriesnitt tas, som sedan kan sammanställas till en tredimensionell bild.
En ytterligare begränsning är att antikroppar och guldpartiklar inte kan penetrera det harts som används för att bädda in prover för avbildning. Således kan endast tillgängliga molekyler målinriktas och visualiseras. Märkning innan provet bäddas in kan minska den negativa effekten av denna begränsning.